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液相色谱问题总结


HPLC 色谱常见问题 1.用 HPLC 进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决? 2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? 3.HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法 4.做 HPLC 分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决? 5.我最近更换了另一种牌号的 ODS 柱, 虽然分离情况仍可以, 但保留时间不重现, 为什么? 6.我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高,请问为什么? 7.色谱双峰产生的可能及判断和处理 8.色谱柱中的流动相会排干吗? 9.使用 PEEK(polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题? 10.液相色谱梯度洗脱中柱温的影响有那些? 11.为何基线会漂移 12.规则的基线噪音是如何产生的 13.不规则的基线噪音是如何产生的 14.保留时间漂移的故障排除 15.为何出现肩峰或分叉? 16.为何出现鬼峰? 17.为何出现峰拖尾? 18.为何出现峰展宽? 19.除了流速外,还有哪些因素能引起压力改变? 20.什么是强溶剂、弱溶剂? 21.怎样才会使峰位发生重排? clin-lab.com 22.除了在线脱气常用的实验室脱气方式还有哪些? 23.评价一个色谱柱的最基本指标有那些? 24.什么是时间常数? 25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰? 26.为何会出现“胖"峰和平头峰?怎样避免? 27.什么是次级保留效应? 28.前延峰的发生及处理? 29.峰变宽的原因? 30.柱平衡慢的常见原因有哪些? 31.用内标法实验时对内标物的要求有哪些? 32.管子切割与安装注意事项? 33.什么是 HPLC 的“无限直径效应"? 34.如何评价一台检测器? 35.如何简单判断比例阀是否内漏? 1.用 HPLC 进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决? 关于漂移问题: ① 温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定 ② 流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 ③ 柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题 ① 流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定

② 泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。 clin-lab.com ③ 流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? ① 筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。 ② 存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子 ③ 可能柱超载,减少进样量。

3.HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法 ① 样品量不足,解决办法为增加样品量 ② 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 ③ 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 ④ 检测器衰减太多。调整衰减即可。 ⑤ 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数 ⑥ 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 ⑦ 检测池中有气泡。解决办法为排气。 ⑧ 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 ⑨ 流动相流量不合适。调整流速即可。 ⑩ 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。 clin-lab.com

4.做 HPLC 分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决? ① 泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理; ② 比例阀失效,更换比例阀即可; ③ 泵密封垫损坏,更换密封垫即可; ④ 溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法; ⑤ 系统检漏,找出漏点,密封即可; ⑥ 梯度洗脱,这时压力波动是正常的。

5.我最近更换了另一种牌号的 ODS 柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什 么? 这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。 尽管过去几年来, 填料的制造技术有了极大的 提高,但不同的厂商的 ODS 填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生 相互作用。因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的 ODS 柱上的相对保留时间就可能

不同。在流动相中加入少量竞争物,如三乙基胺(TEA) ,将会使硅醇基的成键能力饱和, 从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。 如分离情况可以,系统稳定,达到系统适用性要求,就不必保留时间的重现。

6.我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高,请问为什么? clin-lab.com 柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的 问题,您可按下面步骤检查问题的起因。 ① 拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查; ② 把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再 检查; ③ 将柱子的进出口反过来接在仪器上,用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子, (此时不要连接 检测器,以防固体颗粒进入流动池) 。这时,如果柱压仍不下降,再检查;只用于使用过的 柱子。 ④ 更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将 筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系。一般情况下,在进样器与保护柱之间 接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题, SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决 这一问题的最佳选择。

7.色谱双峰产生的可能及判断和处理 HPLC 分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的 条件下(不包括梯度) ,峰型应对称而尖锐。但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样 品处理方法及进样方式不合理下, 会出现各种意想不到的问题, 而对色谱峰难以作出合理的 解释, 尤其对于新手更是如此。 下面根据本人几年工作的体会, 提出一些看法, 向同仁指教。 clin-lab.com

色谱双峰指的是明是一种物质,但在色谱图中出现双峰,而表明含二种物质。我将这种情况 分为四种原因。 1 色谱柱 如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快,双峰的可能性会减少) ,尤其采 用单一纯物质时, 可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失。 如果进样量 少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受 堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反 过来,一般情况下就行了。当然不反冲,正冲有时也会正常的。如果峰拖尾,双峰强弱相差 不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,这是可以将进样那头拧开,将微孔滤片超声,柱 头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种 事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废。 2 溶剂极性及进样量 许多 HPLC 分析者对此可能不以为然,一般的 HPLC 的书籍和文献都不会提到这方面的内 容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前 HPLC 分析多为反相色谱,流动相多为

甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最 佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂,如 纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如定量管为 20ul,此条 件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样) ,且拖尾, 保留时间会提前(相对进样量少而言) ,将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样 品的溶剂与流动相极性相差太大, 而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。 上面提到进样 量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰 紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题) 。将样品稀释再 进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。 临床实验室 3 样品的特性 有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以 一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的 很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其 pH,双峰现象将消失,如红霉素等。有的 样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在 LC-MS 下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图 上较明显,例如我分析过的农药啶虫眯(吡虫清) 。 4 参数 记录的参数一般都内定的,不必修改,但 GC 和 HPLC 的参数是不完全一致的,例 如 C-R3A 数据记录仪上的一般记录时间间隔 GC 为 2ms,HPLC 为 5ms,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多。

8.色谱柱中的流动相会排干吗? 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形: 不慎未及时补充流动相, 泵将溶剂瓶中的流动 相吸干了,HPLC 系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱 中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?事实上, 如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干, 并 不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输 送液体,而不能输送空气。 clin-lab.com 相比之下, 另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱 变干。同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变 干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了,也不一 定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如经氦气脱气的甲醇) 冲洗色谱柱以除去气体。 较低的表面张力有助于浸润填料表面; 已脱气的溶剂应该能够溶解 并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要(以 1mL/min 的流速)冲一个小时或更多的 时间被彻底浸润,恢复到正常状态。

9.使用 PEEK(polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题? 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱, 使用 PEEK 材料制成的管路和接头会非常 方便。PEEK 管路容易连接;PEEK 接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍 之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 使用此类材料的管路需要注意的是:PEEK 对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观

察到上述溶剂溶解 PEEK 材料的明显迹象, PEEK 遇到上述溶剂会变脆。 但 另一个西药考虑 的因素是压力限。不锈钢管可耐受 6000psi 的压力,但 PEEK 管只能耐受近 4000psi(但多 数 HPLC 应用系统压力不会超过 3000psi) 。 clin-lab.com 使用 PEEK 接头时则无需担心接头耐溶剂性能, 因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。 但手 拧固定的 PEEK 接头压力限低于不锈钢管, 因而压力太高时, 可能会使接头在管路上滑动而 产生死体积或漏液。

10. 液相色谱梯度洗脱中柱温的影响 许多色谱工作者在操作液相色谱时, 色谱柱是在室温环境下工作的。 如果实验室的温度能保 持不变的话,不会有什么大问题。但大多数的工作环境温度是不断变化的,因此若想将在某 实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的话,温度的差别就会引起较复杂的问 题。 温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的, 本文就来讨论液相色谱方法中的梯度 洗脱方式受温度影响的问题。 等度保留 大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。 1 显示了三个不同温度下的分离 图 结果。 我们发现当温度升高时所有的色谱峰都前移了, 等度洗脱时一般温度每升高一摄氏度 保留时间会缩短 1-3%,在图 1 中,保留时间变化率约为 2%/℃。 拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置, 但这种设置可能引起室温显著变化, 这对 整夜运行的色谱系统就会有一些影响,例如我们实验室的夜间温度就设为 4-7℃。在不同的 季节, 实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低, 这种温度的变化就会使色谱峰离 开“保留时间窗",造成连续进样中产生一系列的无效数据。 clin-lab.com 还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。 当色谱柱正对着空调的送风口 时,虽然整个实验室的温度非常稳定,但色谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使 用柱温箱的原因之一。 梯度保留 温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。 2 是苯胺和苯酸在三个温度条件下 图 的色谱图。图 1 中,20℃的温度变化引起保留因子的变化大约为两倍,然而在图 2 中,40℃ 的变化使保留改变了约 20%。平均来说,图 2 中的色谱保留变化约为 0.2%/℃。由此可见, 温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响(假定本例具有普遍代表意义) 。即便 如此,若梯度洗脱时不控制温度的话,保留值一般都会有较大的变化。 选择性的变化 比较图 1 和图 2 会发现温度变化能引起选择性显著变化。 1 中, 图 25℃时第二个峰和第一个 峰很接近,但当温度升高后,第二个峰却远离第一个峰,接近第三个峰。从三个图来看,对 于前三个峰的最佳分离条件是 35℃。值得注意的一个有趣现象是,选择性的变化是和成分 相关的,例如图 1 中当温度变化后最后三个峰的相对位置几乎不变。 在图 2 的梯度洗脱示例中,也有选择性变化。峰 1、2、4 和 5 的相对位置没有十分明显的变 化,但是,当温度升高时,峰 3 会移近峰 4。 临床实验室 峰位置的相对变化和温度的变化是有规律可循的。 当条件确定以后, 这个规律就是可预测的。 例如,在图 2 中当温度升至 77℃以上时,峰 3 和峰 4 将会合并。而当温度更高时,峰 3 将 会移到峰 4 之后。温度引起的选择性变化的多年来一直未受重视。最近,施耐德等人发现能

够将温度作为一个调整选择性的有力工具。 1 中的样品在 35℃时可以达到最佳选择性 图 (峰 之间的距离最大) ,而图 2 中的样品在 38℃时可达到最佳选择性(这两份样品的最优温度近 似纯属巧合) 。 温度控制 从实践出发, 1 和 2 的例子说明为了获得一致的结果我们必须要控制柱温, 图 使用柱温箱是 最好的办法。目前商业化的柱温箱有两种形式:直接加热色谱柱和通过空气传热,每种设计 都有其优缺点,而且不同厂商设计的 LC 系统也有不同的限制。在直接加热型柱温箱中色谱 柱是被夹在金属加热器中或被加热器包裹起来; 而在空气传热型的柱温箱和气相色谱柱温箱 很相像,色谱柱是被悬挂在静止或流动的空气中,通过加热空气来保持柱温。第三种设计是 把色谱柱浸在液体中(比如水浴中) ,这在实验室中很容易搭建,但通常这种设计也并不比 其他设计省力。 如果没有柱温箱,最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。例如,可把 色谱柱置于泡沫塑料套中或色谱包装盒中, 当实验室温度基本不变时效果很好, 但这种方法 必须要允许保留有一些波动。隔绝色谱柱也可以避免结果受环境温度影响。 clin-lab.com

温度平衡 我们知道,为了保证分离的重现性,色谱柱在梯度洗脱状态下的必须有平衡过程。当一次梯 度洗脱分离完成后, 一定要用 10-15 倍柱体积的流动相来冲洗柱子以恢复柱子的平衡。 例如, 如果使用 B 溶剂 5-100%的梯度, 柱子为 150mm?4.6mm (柱体积为 1.5ml) 当流动相从 100% , 的 B 溶剂换回到 5%的 B 溶剂时,大概需要保持 1.5ml/min 的流速 10 分钟来恢复系统平衡, 在进行下一次梯度变换之前如果系统没有平衡,那么保留时间的重现性就会很差。 正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样,柱温不平衡也会导致不理想的后 果,这个问题在峰宽上的影响尤其明显。当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外, 峰宽也会发生变化。升高温度通常会使理论塔板数(N)升高,峰宽变窄,由于峰面积不变, 峰越窄就会越高,因此升高温度可以达到更小的检测限。 (这篇文章里的色谱图不是按同一 个 y 轴比例来画的,所以峰高的变化没有表示出来) 不用平衡的流动相充分的冲洗柱子会导致化学不平衡状态, 但是当柱子在程序升温的环境中 我们怎样确定不平衡问题呢?答案取决于柱子中的流动相, 如果柱子是在室温条件下, 溶剂 瓶、泵和自动进样器也在室温下,那么整个系统中的温度就应该是稳定的。但是,如果柱子 是热的, 系统的其他部分和溶剂是室温, 柱头将比柱尾凉。 柱子里的温度变化将会影响峰形。 临床实验室 图 3 所示色谱图中柱温为 38℃, 进柱的溶剂为室温 (约 22℃) 最后一个峰有很明显的变形。 , 把溶剂瓶、泵、自动进样器加热至与柱温相同是不现实的,所以溶剂预热器是最好的选择。 我们用 1 米长,0.25mm 内径的不锈钢管作为预热器,把这个不锈钢管盘成直径大约 10cm 的平面紧贴在柱温箱里的预热器上, 再让流路垂直以便预热器能够位于自动进样器和柱子之 间,这样,凉的溶剂从自动进样器里出来到柱子之前经过这个预热盘升高了温度。图 3 中的 上面一个色谱图就是增加了预热器使峰形得到改善。有一些商品柱温箱就包括这个预热器。 当流动相和柱子之间的温差增大时,由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。比较图 3-5 你 会发现这个问题很富戏剧性。在 77℃时后一个峰变形很大以至于会认为它是两个成份或者 认为柱子有了死体积。 在上述情况下当使用了预热盘以后峰型都变得很漂亮。 虽然由于比例 不同我们无法看出,其实图 3-5 中所有对应成份的峰面积都是不变的。 为什么会看到这些峰变形了呢?这很容易从峰展宽的角度来解释。 前段的温度比尾部的温度

高,所以前段走的快。当前面比后面走的快的时候就会产生展宽的峰。这种现象和梯度洗脱 中有种情况是相对的, 就是在一开始使用弱极性溶剂小流速后用强极性大流速。 虽然使用预 热器来改善峰形是一个很著名的结论(见参考文献 3)但峰变形的原因仍然很复杂。在理想 梯度洗脱中, 每个峰都应该在相同的环境中出来而且以相同的速度通过柱子, 最后得到相同 的峰宽。但是很奇怪后出的峰变形问题比先出的峰要严重,正如图 4 所示。或许读者对这个 现象会有简单的解释。 clin-lab.com

结论 我们发现柱温在液相色谱梯度洗脱过程中扮演了一个重要的角色, 首先, 提高柱温可以缩短 保留时间, 其次, 我们看到柱温还可以影响选择性, 最后, 温度的不平衡会导致峰扭曲变形。 这些提醒我们,如果想得到稳定可靠的分离结果,色谱柱的温度变化是不可忽视的。

11.为何会基线漂移 原因 ① 柱温波动。 (即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检 测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。 ) ②流动相不均匀。 (流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。 ) ③流通池被污染或有气体 ④检测器出口阻塞。 (高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线) ⑤流动相配比不当或流速变化 ⑥柱平衡慢,特别是流动相发生变化时 ⑦流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 ⑧样品中有强保留的物质(高 K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基 线。 ⑨使用循环溶剂,不提倡。未调整检测器。 ⑩检测器没有设定在最大吸收波长处。 解决方法 ①控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器 clin-lab.com ②使用 HPLC 级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用在 线脱气或氦气脱气。 ③用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用 1N 的硝酸。 (不要用盐酸) ④取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。 ⑤更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。 ⑥用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用 10-20 倍体积的新流动相对柱子 进行冲洗。使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱。 ⑦检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂 ⑧改变分析条件。使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗 柱子。 ⑨重新设定基线。使用新的流动相。 ⑩将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长。

12.规则的基线噪音是如何产生的 原因 ①在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰) ②漏液 。 ③流动相混合不完全 。 ④温度影响(柱温过高,检测器未加热) ⑤在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声) ⑥泵振动 。 临床实验室

解决方法 ①流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。 ②检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵 密封。 ③用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 ④减少差异或加上热交换器 ⑤断开 LC、 检测器和记录仪, 检查干扰是否来自于外部, 加以更正。 采用精密级稳压电源。 ⑥在系统中加入脉冲阻尼器

13.不规则的基线噪音是如何产生的 原因 ①漏液。 ②流动相污染、变质或由低质溶剂配成 ③流动相各溶剂不相溶 ④检测器/记录仪电子元件的问题 ⑤系统内有气泡 ⑥检测器内有气泡 ⑦流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。 ) ⑧检测器灯能量不足 ⑨色谱柱填料流失或阻塞 ⑩流动相混合不均匀或混合器工作不正常 解决方法 ①检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。 检查流通池是否漏液。 ②检查流动相的组成。 ③选择互溶的流动相 临床实验室

④断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。 ⑤用强极性溶液清洗系统 ⑥清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器 ⑦用 1N 的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池 ⑧更换灯 ⑨更换色谱柱 ⑩维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置

14.保留时间漂移的故障排除 保留时间不重现有两种不同的情况: 既保留时间漂移和保留时间波动。 前者是指保留时间仅 沿单方向发生变化, 而后者指保留时间无固定规律的波动。 将此两种情况区分开来对找到问 题的原因往往很有帮助。如,保留时间的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留 时间的无规律波动。事实上,保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化,如固定相 流失(例如通过水解) ,色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。保留时间漂移的几种最常 见的原因如下: 一 色谱柱平衡 如果我们观察到保留时间漂移, 首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。 通常平衡需要 10-20 个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当 长的时间来平衡色谱柱。 流动相污染也可能是原因之一。 溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上, 从而 造成保留时间的漂移。应注意:水是很容易污染的流动相成分。 clin-lab.com 二 固定相稳定性 固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的 PH 范围内使用,固定相也会慢慢水解。例如, 硅胶基质在 pH4 时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和 三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定; 长链键合相比短链键合相稳定; 烷基键合相 比氰基键合相稳定的多。 经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。 其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以 发生水解,如氨基键合相等。 三 色谱柱污染 保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC 色谱柱是非常有效的吸附性过滤器, 它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接 管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。 样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分, 就可能是使保留时间漂移的潜在根源。 这些根源 通常是样品基质。如:配药中的赋形剂,生化样品(如血清)中的蛋白及类脂类化合物,食 品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在 此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取(SPE)等 样品前处理方法来去除样品基质的影响。 临床实验室 避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。 相比之下, 找到问题的所在并设计有效的清洗 步骤以去除污染物要困难的多。 通常使用在给定色谱条件下的强溶剂, 但并非所有污染物都 可以在流动相中溶解。如 THF 可去除反相色谱柱中的许多污染物,但蛋白在 THF 中就不能 溶解。DMSO 常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。

使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。 四 流动相组成 流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。 如流动相中易挥发组分的挥发及循环 使用流动相等。 五 疏水坍塌 当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近 100%的水为流动相时,有时会发生分 离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象, 这就是疏水坍塌。 此现象是由 流动相不浸润固定相表面而致。 挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相, 再 用高水含量的流动相进行平衡。 色谱柱长期储存也会发生此现象。 使用内嵌极性基团的反相 色谱柱(如 Waters SymmetryShield RP 色谱柱)或非端基封口的色谱柱(如 Waters Resolve 色谱柱)也可避免发生坍塌。 (一)保留时间变化 ①柱温变化--柱恒温 临床实验室 ②等度与梯度间未能充分平衡--至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱 ③缓冲液容量不够--用>25mmol/L 的缓冲液 ④柱污染--每天冲洗柱 ⑤柱内条件变化--稳定进样条件,调节流动相 ⑥柱快达到寿命--采用保护柱 (二)保留时间缩短 ①流速增加--检查泵,重新设定流速 ②样品超载--降低样品量 ③键合相流失--流动相 PH 值保持在 3~7.5;检查柱的方向 ④流动相组成变化--防止流动相蒸发或沉淀 ⑤温度增加--柱恒温 (三) 保留时间延长 ①流速下降--管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 ②硅胶柱上活性点变化--用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 ③键合相流失-- 同前(二)3 ④流动相组成变化--同前(二)4 ⑤温度降低--同前(二)5

15.为何出现肩峰或分叉? ①样品体积过大--用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% ②样品溶剂过强--采用较弱的样品溶剂 ③柱塌陷或形成短路通道--更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 临床实验室 ④柱内烧结不锈钢失效--更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 ⑤进样器损坏--更换进样器转子

16.为何出现鬼峰? ①进样阀残余峰--每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 ②样品中未知物--处理样品 ③柱未平衡--重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱) ④三氟乙酸(TFA)氧化--每天新配,用抗氧化剂 ⑤水污染(反相)--通过变化平衡时间检查水质量,用 HPLC 级的水

17.为何出现峰拖尾? ①柱超载--降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 ②峰干扰--清洁样品,调整流动相 ③硅羟基作用--加三乙胺,用碱致钝化柱,增加缓冲液或盐的浓度降低流动相 PH 值,纯化样 品 ④柱内烧结不锈钢失效--更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 ⑤柱塌陷或形成短路通道--更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 ⑥死体积或柱外体积过大--连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径 的连接管 ⑦柱效下降--用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 临床实验室

18.为何出现峰展宽? ①样品体积过大--用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% ②在进样阀中造成峰扩展--进样前后排出气泡以降低扩散 ③数据系统采样速率太慢--设定速率应是每峰大于 10 点 ④检测器时间常数过大--设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10% ⑤流动相粘度过高--增加柱温,采用低粘度流动相 ⑥检测池体积过大--用小体积池,卸下热交换器 ⑦保留时间过长--等度洗脱时增加强溶剂含量,也可用梯度洗脱 ⑧柱外体积过大--将连接管径和连接管长度降至最小 ⑨样品过载--进小浓度小体积样品

19.除了流速外,还有哪些因素能引起压力改变? 改变流动相组成和温度;改变柱长、柱内径和填料粒度;柱突然阻塞压力升高(正常情况下 其它条件不变柱压都是逐渐升高的) 。

20.什么是强溶剂、弱溶剂? 改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。 在一定条件下, 减少 保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂,增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。

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21.怎样才会使峰位发生重排? 在分析多组分样品时,仅改变流动相的强度(组成百分比)而不改变其组成,一般仅仅改变 所有组分的保留时间,不会发生峰位的重排。 下列条件改变可能发生峰位重排:流动相中换了强溶剂;PH 值的改变;柱填料的改变;柱 温的改变;流动相的组成改变(如加入离子对试剂三乙基胺等) 。

22.除了在线脱气,常用的实验室脱气方式还有哪些? 加热回流脱气,脱气效果最佳,但无法保持;氦脱气,此方法脱气效果佳,能除去百分之九 十以上的空气,但氦气价格太贵,所以用的不多;真空脱气,效果仅次于氦脱气,但脱气过 程中容易造成样品溶液挥发损失;超声脱气,只能脱去约百分之三十的空气,但在实验室中 最常用。目前还是尽量争取用在线脱气,方便且效果好。

23.评价一个色谱柱的最基本指标有那些? 评介一根色谱柱的基本指标是:塔板数、峰不对称因子、柱压降、适用范围和键合相浓度以 及峰容量。

24.什么是时间常数? 时间常数实际上是响应时间的设定,起着过滤噪音的作用。时间常数太小(太快)可能增加 短噪音,时间常数太大(太慢)可能出宽峰、拖尾峰。 临床实验室

25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰? 所用的流动相在检测波长下有吸收, 而进在此波长下没有吸收或吸收低于流动相的溶液, 在 流动相中会出现洞穴,通过柱后出现倒峰。

26.为何会出现“胖"峰和平头峰?怎样避免? 用比流动相强度大的大体积样品进样,通常会损害色谱图的质量,而出现“胖"峰和平头峰。 应遵循下列规则选用溶剂溶解样品:A 最好用流动相溶解样品进样。B 用大体积弱溶剂溶解 样品, 如反相色谱中用水溶解样品进样, 主要缺点是每次进样后在色谱图的开头出现大的负

峰,有时还波及到样品峰。C 需要时用强溶剂溶解进样。

27.什么是次级保留效应? 在良好的色谱分离中,样品分子是以单一的保留过程被保留。如在反相色谱中,溶质与柱填 料的非极性烷基链发生疏水性相互作用。 但在以硅胶为基质的填料中, 有些样品组分能与硅 醇基团相互作用,脱附的过程很慢,使峰严重拖尾,这就是次保留过程。对付次保留效应最 有效的方法就是选用封尾更好色谱柱或加入流动相改良剂(也叫扫尾剂) 。

28.前延峰的发生及处理? 因柱温问题很易引起前延峰, 有些样品在常温下分离可见前延峰, 提高温度后前延峰的现象 消失。在离子对色谱中,前延峰的另一个原因是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱 中要求仅用流动相溶解样品,而且进样量不要太大,否则会导致前延峰或其它问题。在 RP-HPLC 中样品溶液的强度大于流动相引起前延峰。增加流动相的强度,减少样品溶液的 强度,在离子对色谱中增加离子强度,可以克服前延峰的效应。此外使用流动相溶解样品是 解决的最简单实用的方法。 clin-lab.com

29.峰变宽的原因? A 在使用过程中柱本身退化,逐渐降低柱效。B 柱外峰宽效应。一根很好的专用柱用于另一 液相色谱系统引起塔板数降低,说明新系统有很大的柱外峰宽效应。C 化学效应,多数是流 动相和固定相相互作用所致,改变流动相可使宽峰有所改善。

30.柱平衡慢的常见原因有哪些? 柱平衡慢的常见原因是, 组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强, 或者在新的流动相中浓度 小甚至为零。A 流动相含有胺改良剂;B 流动相含有离子对试剂;硅胶柱;流动相中有四氢 呋喃。可考虑采用专用柱用于特殊的方法,不用时将柱折下来,注满适当的溶剂或流动相, 密封保管,不再作其它的分析。

31.用内标法实验时对内标物的要求有哪些? A 内标物的结构或理化性质应与被分析组分相似或相近; 内标物的保留值应稍大于或小于 B 被分析物的保留,不能相差过大;C 内标物的峰要与所有被分析物的峰有良好的分离度(R 大于 1.5) ,不能让内标物成了干扰物;D 无结构相似的内标物,可用保留相近的内标物;E

仪器对分析物的响应与内标基本一致,出峰面积大小不能相差悬殊。

32.管子切割与安装注意事项? 临床实验室 A 管子的断面必须垂直,否则,将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。B 确保管子内表面 不被损伤,如果损伤,可能会发生管路堵塞。C 将管子完全插入开口端,直至其与开口端的 末端相碰为止。否则,将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。D 不要过分拧紧螺帽,以防 损坏螺纹。

33. 什么是 HPLC 的“无限直径效应"? 在 HPLC 分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相,样品以柱塞式注入色谱柱后, 因柱的阻力大, 样品分子在柱中的分子扩散很小, 直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接 触,因而引起的色谱峰形扩展很小,能保持高柱效。

34.如何评价一台检测器? A 噪声:通常噪声是指由仪器的电气元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用 产生的高频噪声和基线的无规则波动; B 基线飘移:漂移是基线的一种向上或向下的缓慢移动,可在较长时间(0.5~1h)内观察到。 它可掩蔽噪声和小峰。漂移与整个液相色谱系统有关,而不仅是由检测器引起的; C 灵敏度(最小检出浓度或最小检出量) :在一个特定分离工作中, 检测器是否有足够的灵 敏度是十分重要的。当比较检测器时,常使用敏感度这一性能指标。敏感度即指信号与噪声 的比值(信噪比)等于 2 时,在单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量; 临床实验室 D 线性范围:在进行定量分析时,希望检测器有宽的线性范围,以便在一次分析中可同时对 主要组分和痕量组分同时进行检测; E 检测器的池体积:它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 1/10,否则会产生严重 的柱外谱带扩展。

35.如何简单判断比例阀是否内漏? 设定泵使用一个单独通路(A) ,打开 Purge 阀,流速 5ml/min,提起其他溶剂瓶内的溶剂过 滤头直至离开液面,观察这些通路(B、C、D)内的溶剂是否随着流动,正常时均不应流 动 文 章 来 自 临 床 实 验 室 仪 器 信 息 网 (www.Clin-Lab.Com) - 详 文 链 接 : http://www.clin-lab.com/html/haocai/sepu/2010/0402/20696.html


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