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荧光定量PCR引物设计软件说明书(PrimerExpress


Primer Express Operation Guide

Primer Express v3.0
Primers and Probe Design For Real-Time PCR

Primer Express Operation Guide

Primers/Probes Design Guideline
TaqMan Probe
Probe Primer ? , PCR G/C % ? Tm 65-67 : 68-70 (Quantification assay) 30-80 % 4 G Tm : 58-60

Primer
50-150 bp

(Allelic Discrimination assay)

Probe

?:

Primer

?:

13~25 bases (TaqMan MGB probe) 13~30 bases (TaqMan probe) ? 5’ ( FAM-dye C 3’ G 4 5’ strand ?? 6 A ?? ? G ? probe 3 ?
b

20 bases (Optimal)

3’

???

2

C+G

G)

G

(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’) a probe a: b: ?? 2 CC di-nucleotides a

TaqMan MGB probe

Primer Express Operation Guide

Primers & Probes for Quantification
Automatically Design
Primer Express 3.0 File→ New→ “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”→ OK

Tools →

“Add DNA File”

? Copy & Paste

”Add” ?

?

”Sequence” Tab

* Primer Express Software (? ? database download

.dan, .txt, .ab1, ? ,

.abi ?

, ?)

?

Primer Express Operation Guide
” Double Strand “, double stranded DNA sequence

Tools 1. Exclude:? ? ? ? ? ”Exclude Selected Bases” “Exclude” ? ?

Primer Express Operation Guide
? ? juction ? 2 bases)

2.

Junction:

junction (

”Junction” “Junction” ?

3.

”Parameters” Tab

Primer/Probe Tm

Primers/Probe

Primer Express Operation Guide
”Sequence” Tab Tools → Find Primers/Probes

Primers/Probe pairs

Primer Express

Candidate Primers & Probe pairs ”Location”?

search primers & probes ?

50

? ”Primers / Probes” Tab ?

”Sequence” Tab Probe ? )

”Primers / Probes” Tab Forward Primer

Primers/Probe: Reverse Primer (* ?

Primer Express Operation Guide
”Primers / Probes” Tab 2 ”C ” ”G” Primers/Probe ? ? MGB Probe ”Parameters” Tab

primer/ probe design guideline ? ??

primer/ probe set primer/ probe set ?

? Export → Order Info… ?

File → Save As 50 ? .txt Primers/Probes Excel

Export →Primers/Probes List…

Primer Express Operation Guide

Manually Design
Primer/Probe
Quantification Document ?

Primer/Probe
(? 3 )

1.

Probe ”Sequence” Tab ) ?

: Probe Copy (Ctrl+C) ? highlight ? ( ? 25 bases ? ? ?

Edit

Tools→ Primer Probe Test Tool TaqMan Quantification”) Probe 1 ?

document type ( Parameter ? Tm, %GC ”Default” ? ?? G ?

“TaqMan MGB Quantification Paste (Ctrl+V) ?

: probe

??

C

?

G

? Tm Tm, %GC

(68 ? ”Trim”

to 70

)

Probe 1 ? Probe ( ? ?

?

?

primer/ probe design guideline) ? ? Probe ?

Primer Express Operation Guide
Probe ? ”Sequence” Tab probe ? ? Probe probe ? highlight ? ? ? Edit →

Annotate → ” Probe”

? Primers ?

Tools → Find Primers/Probes Primers

Probe

Forward / Reverse

? Forward / Reverse Primers

Primer Express Operation Guide
2. Forward Primer ”Sequence” Tab ) ? ? ? Edit : Primer Copy (Ctrl+C) ? ? highlight ?( ? Fwd Primer ? 25 bases ? ? Probe ? Tools → Primer Probe Test Tool ? Tm, %GC

Paste (Ctrl+V)

Forward Primer ? guideline) ? Fwd Primer Primer” ? ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC ?

Tm

?

Fwd Primer Primer ( ? ?

?

primer/ probe design ?

”Trim”

”Sequence” Tab Fwd Primer ?

? highlight

?

?

” Forward

Primer Express Operation Guide
3. Reverse Primer ”Sequence” Tab ) Primer ? ? Reverse ? highlight ? ?( 25 bases ? ? Probe ? Rev Edit →” Copy Complement ” Tools → Primer Probe Test Tool

Reverse Primer ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC

Tm ? ”Trim”

?

Rev Primer Primer ( ? ? primer/

probe design guideline) ? Rev Primer Primer” ? ? ?

?

”Sequence” Tab Rev Primer

? highlight

?

?

” Reverse

Primer Express Operation Guide
primer/ probe set ? ? Copy & Paste document ? text save ? ??

File → Save As

Primer Express Operation Guide

SYBR Green I Primer for Quantification
Automatically Design
Primer Express 3.0 File→ New→ “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”→ OK

Tools →

“Add DNA File”

? Copy & Paste

”Add” ?

?

”Sequence” Tab

* Primer Express Software (? ? database download

.dan, .txt, .ab1, ? ,

.abi ?

, ?)

?

Primer Express Operation Guide
” Double Strand “, double stranded DNA sequence

Tools 1. Exclude:? ? ? ? ? ”Exclude Selected Bases” “Exclude” ? ?

Primer Express Operation Guide
? ? juction ( ?

2.

Junction:

junction 2 bases)

”Junction” “Junction” ?

3.

”Parameters” Tab

Primer Tm

Primers

Primer Express Operation Guide
”Sequence” Tab Tools → Find Primers/Probes

Primers/Probe pairs

Primer Express ? ?

Candidate Primers & Probe pairs ?

search

50 ? ? probe

”Primers / Probes” Tab ? ? primer ?

? SYBR Green primer primers & probes

”Location”?

”Sequence” Tab Probe ? )

”Primers / Probes” Tab Forward Primer

Primers/Probe: Reverse Primer (* ?

Primer Express Operation Guide
”Primers / Probes” Tab 2 Primers/Probe ? ?

primer/ probe design guideline

* SYBR Green primer ”Primers / Probes” Tab Hairpin, Self Dimers GC ?

primer dimer primer set Cross Dimers ? ? Primer Secondary Structure

Primer Express Operation Guide
primers set ? primers set Primers/Probes Excel ? File → Save As Export → Order Info… ? ? .txt 50

Export →Primers/Probes List…

Primer Express Operation Guide

Manually Design
Primer
Quantification Document

Primer
? (? 13 )

1.

Forward Primer ”Sequence” Tab ? Edit

: Primer ? highlight ? ?( 25 bases ? ? ? ) Tools → Primer Probe Test Tool TaqMan Quantification”) Fwd Primer ?

Copy (Ctrl+C)

document type ( Parameter ? ”Default” Tm, %GC ? ?

“TaqMan MGB Quantification Paste (Ctrl+V) ?

Forward Primer ? guideline) ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC ?

Tm

?

Fwd Primer Primer ( ? ?

?

primer/ probe design ?

”Trim”

Primer Express Operation Guide
2. Reverse Primer ”Sequence” Tab ) Primer ? ? : Reverse ? highlight ? ?( 25 bases ? ? ? Rev Tools → Primer Probe Test Tool

Edit →” Copy Complement ”

Reverse Primer ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC

Tm ? ”Trim”

?

Rev Primer Primer ( ? ? primer/

probe design guideline) ? ?

?

Primer Express Operation Guide
3. SYBR Green primer Primer Probe Test Tool Primers GC ? primer set primer dimer ”Show Secondary Stucture” Cross Dimers ? ?

Hairpin, Self Dimers primer

Fwd Primer Primer”

? ?

”Sequence” Tab Fwd Primer ?

? highlight

?

?

” Forward

Primer Express Operation Guide
Rev Primer Primer” ? ? ”Sequence” Tab Rev Primer ? highlight ? ? ” Reverse

primer/ probe set ?

?

Copy & Paste document ?

text

save

?

??

File → Save As

Primer Express Operation Guide

Primers & Probes for Allelic Discrimination
Automatically Design
Primer Express 3.0 File→ New→ “TaqMan MGB Allelic Discrimination ? TaqMan Allelic Discrimination”→ OK

TaqMan MGB probe

Tools →

“Add DNA File”

? Copy & Paste

”Add” ?

?

”Sequence” Tab

* Primer Express Software (? ? database download

.dan, .txt, .ab1, ? ,

.abi ?

, ?)

?

Primer Express Operation Guide
SNP SNP highlight Edit → Annotate → “SNP Target ” SNP ? (variant)

?

528 r

G/A

SNP

G

A

”R”

OK

SNP

Primer Express Operation Guide
Tools → Find Primers/Probes

Primers/Probes pairs

Primer Express

Candidate Primers & Probes pairs ”Location”?

search primers & probes ?

50

? ”Primers / Probes” Tab ?

”Sequence” Tab Probe 1 Forward Primer ?

”Primers / Probes” Tab Probe 2 Reverse Primer (2 Probe (*

Primers/Probes: ? ? ? ) ? )

Primer Express Operation Guide
”Primers / Probes” Tab 2 ”C ” ”G” Primers/Probe ? ? MGB Probe ”Parameters” Tab

primer/ probe design guideline ? ??

primer/ probe set

? ?

File → Save As Export → Order Info… ? ? .txt

primer/ probe set 50 Primers/Probes Excel

Export →Primers/Probes List…

Primer Express Operation Guide

Manually Design
Primer/Probe
Allelic Discrimination Document

Primer/Probe
? (? 23 )

1.

Probe for Allele 1: ”Sequence” Tab SNP ?) ? Edit SNP ? ( ? highlight 24 ) ? Edit → Annotate → “SNP Target ” ?( 13~25 bases Tools→ Primer TaqMan Probe1 ? Tm,

Probe1

? highlight ?

Copy with Allele 1 (Ctrl+Shift+W) document type ( Parameter

Probe Test Tool Allelic Discrimination”) ? %GC

“TaqMan MGB Allelic Discrimination ? ”g”) Paste (Ctrl+V) ?

”Default” ( ?

Allele 1 variant base ?

: probe

??

G

??

C

?

G

Primer Express Operation Guide
? Tm Tm, %GC (65 ? ”Trim” to 67 ) Probe 1 ? Probe ( ? ? ? ?

primer/ probe design guideline) ? ? Probe ?

SNP SNP ? Probe base ? 3’ 2 base ?

Primer Express Operation Guide
2. Probe for Allele 2: ”Sequence” Tab Probe2 ? highlight ? ?( 13~25 bases ?) ? Edit ?

Copy with Allele 2 (Ctrl+Shift+M) Paste (Ctrl+V) ”a”) ? Probe2 ? ? Tm, %GC

Tools→ Primer Probe Test Tool ( ?

Allele 2 variant base ?

? Tm Tm, %GC

(65 ? ”Trim”

to 67

)

Probe 1 ? Probe ( ? ?

?

?

primer/ probe design guideline) ? ? Probe ?

probe1

probe2

Tm

??

1

Primer Express Operation Guide
3. Forward Primer ”Sequence” Tab ) ? ? ? Edit : Primer Copy (Ctrl+C) ? ? highlight ?( ? Fwd Primer ? 25 bases ? ? Probe ? Tools → Primer Probe Test Tool ? Tm, %GC

Paste (Ctrl+V)

Forward Primer ? guideline) ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC ?

Tm

?

Fwd Primer Primer ( ? ?

?

primer/ probe design ?

”Trim”

Primer Express Operation Guide
4. Reverse Primer ”Sequence” Tab ) Primer ? ? : Reverse ? highlight ? ?( 25 bases ? ? Probe ? Rev Tools → Primer Probe Test Tool

Edit →” Copy Complement ”

Reverse Primer ? ?

Tm

58-60 Tm, %GC

Tm ? ”Trim”

?

Rev Primer Primer ( ? ? primer/

probe design guideline) ? ?

?

Primer Express Operation Guide
primer/ probe set ? ? Copy & Paste document ? text save ? ??

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: 0800251326 TWSupport@appliedbiosystems.com

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