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促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤保护作用的研究


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促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤 保护作用的研究
原睿智,张新定,冯伟,韩广,韩彦明,周旺宁,程得均,冯广才
兰州大学神经病研究所,兰州大学第二医院神经外科,兰州(730030)
E-mail:zhangxinding@126.com

摘 要:目的 探讨促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障、脑水肿、损伤体积和 血清神经元特异性烯醇化酶的影响。 方法 应用 Feeney 氏法制作大鼠创伤性脑损伤实验模 型。48h 后测脑组织 EB 含量观察血脑屏障的破坏程度、干湿重法测脑水含量、TTC 染色法 测定损伤体积。24h 时放免法测定血清 NSE 含量。结果 EPO 治疗组与对照组相比血脑屏障 破坏程度显著较轻。EPO 治疗组脑水肿较对照组轻。EPO 治疗组脑损伤体积较对照组明显 小。EPO 组血清 NSE 水平也较对照组低。结论 EPO 能维持血脑屏障的完整性,缩小损伤 体积,减轻脑水肿和神经元的损害。 关键词:促红细胞生成素;创伤性脑损伤;神经元特异性烯醇化酶 创伤引起的原发性和继发性脑损伤仍是导致人们伤残和死亡的主要原因。 尽管抗炎、 抗 凋亡、 抗自由基等制剂具有脑保护作用, 但是现在临床上还没有一种药物能完全阻止继发性 脑损害。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是由 165 个氨基酸组成的分子量为 34000 的糖蛋白,具有促进骨髓红系母细胞增殖和分化,调节红细胞的生成作用,目前临床上主要 用于治疗肾功能不全引起的贫血。 最近研究发现 EPO 及其受体 (erythropoietin recptor,EPO-R) 系统不仅以内分泌的形式存在于肾脏和骨髓内, 它们还以自分泌或旁分泌的形式存在于神经 系统、肌肉组织(骨骼肌、平滑肌、心肌)和生殖系统(睾丸和子宫) 。国内外的研究证实 EPO 在缺血再灌注、缺血缺氧、蛛网膜下腔出血、脑梗死、癫痫、脊髓损伤等试验模型中 具有神经保护功能 1 。 本实验通过大鼠实验观察 EPO 对创伤性脑损伤 (Traumatic brain injury,
[ ]

TBI)是否具有保护功能,为脑外伤的临床治疗提供一条新途径。

1. 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
促红细胞生成素(华北制药金坦生物技术股份有限公司) ;KDC-2046 低温大容量离心 机;电子天平;100℃恒温烘干箱;伊文思蓝(西安沃尔森生物技术有限公司) ;氯化-2,3,5三苯基四氮唑溶液(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride ,TTC)(西安沃尔森生 物技术有限公司) ;NES 试剂盒(北方生物技术研究所) ;自制落体打击器;荧光分光光度 计(日本产 Hitachi 650-60 型);

1.2 实验动物分组与模型建立
1.选取 66 只健康 Wistar 大鼠(兰州军区总医院动物中心) ,雌雄不限,重量 250~350g。 随机分成假手术组 18 只、对照组 24 只、EPO 治疗组 24 只。造模成功治疗 24h 后每组取 6 只测定血清 NSE 含量。48h 后每组各取 6 只测定脑组织水含量、脑损伤体积和血脑屏障的 完整性。 2.采用 Feeney 氏法制作大鼠重度颅脑损伤模型
[2]

。大鼠用 10%水合氯醛(300mg/kg,

3ml/kg)腹腔注射麻醉后,俯卧固定于立体定位仪上,矢状切开头皮,显露右顶骨,在人字 缝前 2mm,矢状缝右侧 2mm,牙科钻钻一小孔并扩大骨窗直径至 5mm。将中心粘有直径

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3mm、高 4mm 圆柱体的硬塑料板(直径 10mm、厚 5mm)放置于大鼠右侧顶叶,其中心圆 柱置于钻孔内。用 25g 砝码于 30cm 高度自由落下造成大鼠右侧重度脑损伤,止血后缝合头 皮。造模成功后 EPO 治疗组立即腹腔注射 rhEPO(5000U/kg) ,于 24 小时后再注射一次。 对照组模型制作方法与 EPO 组相同,但制模后仅腹腔注射等量生理盐水。假手术组仅用上 述方法暴露硬膜但不致伤。

1.3 实验方法及指标检测
1.3.1 血脑屏障破坏程度检测 伊文思蓝(Evans Blue,EB)是一种分子量与血液中白蛋白相近的染料制剂,可以与血 液中的白蛋白结合,常作为示踪剂检测血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的完整性。48h 后 EPO 治疗组和对照组各取 6 只大鼠尾静脉注射 2%的 EB(3ml/Kg) 。体内循环 60min 后, 用生理盐水左心室灌注直到流出液变为清亮。参照 Baskawa MK[3]的方法,取损伤侧脑组织 在分析天平上秤量其湿重,将其放入匀浆器中,加 2 ml 的 50%(w/v)三氯乙酸(TCA)充分匀浆 后, 15000 rpm 离心 20 min,取 1 ml 上清与 3 ml 无水乙醇混合,在荧光分光光度计 Ex620 nm、 Em680nm 的条件下进行比色,依据其 OD 值计算出 EB 的浓度。 校零标准品为 50%TCA 按 1∶3 加入无水乙醇。使用校零标准品配制不同浓度(100~1000 ng/ml)的 EB 测定其 OD 值,以绘制 出标准曲线(结果呈线性关系)。依据所测得浓度计算 BBB 对 EB 的通透率,以每克湿重脑组 织内所含 EB 的量表示。 1.3.2 脑组织水含量测定 采用干、湿重法,各组大鼠建模 48h 后,断头取脑,取伤侧(各组均取右侧)大脑半球脑组 织标本,电子天平称取湿重(室温 20~25℃,湿度 70%~90%)将标本置于 100±2℃恒温干燥箱内 烘干 24h 至恒重,称取干重。脑水含量=(湿重-干重)/湿重×100%。 1.3.3 脑损伤体积测定 参照 Mathews [4]的方法各组大鼠 48h 后,10%的多聚甲醛进行心脏灌注固定,快速取出 伤侧脑组织置于-20°C 冰箱短暂冷冻后,置于冰盘上操作。去掉嗅球、小脑和部分低位脑干, 剩余部分由前后冠状切成 1mm 组织片,然后置于 2%氯化-2,3,5 三苯基四氮唑(TTC)染色溶液 中 37°C 避光温孵 30min。正常组织染成红色,损伤组织呈白色。完全显色后标本于 4℃的 10 %福尔马林溶液中固定 7d。TTC 染色的脑片以 CCD(charge-coupled device ,CCD)数码相机 (WV-CP-230,Panasonic)摄像后输入计算机, TTC 染色每一脑片的损伤面积,面积乘以厚度,并 迭加每片数据后计算损伤体积。 1.3.4 血清 NSE 水平测定 各组大鼠 24h 各取 6 只心脏采血,用双抗体夹心法测定血清 NSE 含量。样品中的 NSE 与包被球上的 NSE 抗体结合, 再与 125I-抗 NSE 结合, 形成免疫复合物, 测定包被球的 CPM (cents per minute, CPM)值,即可检测样品中的 NSE 含量。

1.4 统计学分析
应用 SPSS11.5 软件对数据进行处理,计量数据以 意义。
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表示,多个样本均数间的比较采

用单因素方差分析,多个样本均数间的多重比较采用 Dunnett-t 检验,P<0.05 为具有统计学

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2. 结果
2.1 血脑屏障破坏程度
48h 后,假手术组 EB 通过率最低。与对照组比较 EPO 治疗组伤侧脑组织 EB 的通过率 显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表 1
表1 Table1 EB 通过率( ) )

permeability of EB(

组别 对照组

n 6 6 (右侧脑组织) 6

EB 含量(?g/g) 12.6±1.2 182.8±15.9 * 67.3±13.1 *△

假手术组 (右侧脑组织) EPO 治疗组(右侧脑组织)

*与假手术组比较 P<0.01;△与对照组比较 P<0.01 *P<0.01 vs sham operation group;△P<0.01 vs control group

2.2 脑水含量
干湿重法测得 EPO 治疗组和对照组伤侧脑组织含水量较假手术组明显升高(P<0.01)。 EPO 治疗组与对照组相比伤侧脑水含量明显降低,有显著性差异(P<0.01)。见表 2
表2 脑组织水含量( ) )

Table2 brain water content(

组别 假手术组 对照组

n

脑组织水含量(%) 71.1±0.2 91.8±0.6* 80.6±0.2*△

(右侧脑组织) 6 (右侧脑组织) 6 6

EPO 治疗组 (右侧脑组织)

* P<0.01 与假手术组比较;△P<0.01 与对照组比较 *P<0.01 vs sham operation group;△P<0.01 vs control group

2.3 受伤侧脑损伤体积
48h 后 TTC 染色, 数据输入计算机得出对照组和 EPO 治疗组比假手术组较损伤体积明显 增大(P<0.01);EPO 治疗组损伤体积较对照组明显缩小,差异有显著性(P<0.01)。见表 3
表3 损伤体积( ) )

Table 3 brain injury volume(

组别 假手术组 对照组

n (右侧脑组织) (右侧脑组织)

损伤体积(mm3) 6 6 6 0 37.7±3.8* 17.9±4.0*△

EPO 治疗组 (右侧脑组织)

* P<0.01 与假手术组比较;△P<0.01 与对照组比较 *P<0.01 vs sham operation group;△P<0.01 vs control group

2.4 脑外伤后 24h 血清 NSE 含量
EPO 治疗组和对照组血清 NSE 含量较假手术组明显升高(P<0.01) ,EPO 治疗组 NSE 含量较对照组明显较低(P<0.05) 。见表 4
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http://www.paper.edu.cn 表4 Table 4 血清 NSE 含量( NSE levels in serum( ) )

组别 假手术组 对照组 EPO 治疗组

n 6 6 6

NSE 含量(ng/ml) 2.35±0.64 10.02±1.50 * 6.28±3.37 *△

*P<0.01 与假手术组比较;△P<0.05 与对照组比较 *P<0.01vs sham operation group;△P<0.05 vs control group

3. 讨论
脑外伤可以引起认知功能、运动功能、意识和感觉的缺损或者丧失。其根本原因是神经 元、神经胶质细胞、内皮细胞的水肿、变性、凋亡或死亡。目前国内外研究较多的神经保护 剂种类较多但效果并非十分满意。尽管EPO在体内外的多种实验中具有保护脑损伤的作用, 但对于其在实验性创伤性脑损伤中的研究较少。 Lu等在脑外伤实验中证实了EPO具有增强神 经元的再生和空间记忆的恢复
[5]

。 Ozturk等在大鼠闭合性脑损伤实验中证实EPO能明显降低
[6]

血清中丙二醛(多不饱和脂肪酸的主要终产物,可以反映氧化应激水平)的含量和血清中 NO的含量,具有抗氧化应激的作用 。本实验延续了国内外学者关于EPO在神经系统保护 作用的研究,证实了EPO对大鼠创伤性脑损伤具有保护作用,体现在减轻脑组织水肿、维持 血脑屏障的完整性、减小脑组织的损伤体积、降低神经元的损伤程度。 腹腔注射给药后EPO通过血脑屏障进入中枢神经系统的机制尚未完全清楚。 但多数学者 认为脑内毛细血管内皮细胞表达EPO-R, EPO与其受体结合可能是透过血脑屏障进入脑组织 的主要原因,而且EPO发挥神经保护作用也主要通过EPO-R起作用。EPO-R属于Ⅰ型细胞因 子受体超家族。最新研究发现EPO的刺激造血和组织保护特性具有独立性,即通过不同的信 号转导途径发挥作用
[7]

。EPO介导神经保护作用的EPO-R与GM-CSF、IL-3、IL-5等受体具 。

有相同的亚单位CD131

[8]

脑外伤造成的血脑屏障破坏是产生血管源性脑水肿的主要原因,因此在外伤性脑水肿的 研究中,BBB 功能是一个重要的指标。在我们的试验中 EPO 治疗组较对照组 EB 通过率明显 较低,证实了 EPO 具有维持血脑屏障完整性的作用。Martine-Estrada 等 Keoqh 等
[10] [9]

研究其机制可能

是 EPO 通过降低内源性 NO 合酶和修复内皮细胞连接而降低 VEGF 诱导的血脑屏障破坏。 研究还发现 EPO 具有减少内皮细胞的死亡和促进微血管的生成作用。
[11]

本实验证实了EPO治疗组与对照组相比能缩小脑损伤的体积。 Wang等 其存活。Li等
[12]

研究其可能机

制是通过促进脑内毛细血管内皮细胞的增值和迁移, 为缺血细胞提供血流和营养物质, 维持 也发现EPO可以促进血管生成的葡萄糖转换因子-1和5-溴基-2-脱氧尿嘧啶 核苷含量增加;上调血管内皮细胞中EPO受体表达;还能上调血管生成素-2和血管内皮细胞 生长因子-1表达。 脑水肿是颅脑外伤的主要并发症,且由其引起的颅内压增高是脑外伤患者早期死亡的主 要原因。目前的临床保守治疗主要通过高渗液体、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂、肾上腺皮质激 素治疗脑水肿, 使脑外伤的死亡率明显下降, 所以通过不同的途径治疗脑水肿仍然是国内外 学者关注的焦点。 等人 Lee
[13]

在 SD 大鼠实验性脑出血研究中使用 EPO5000U/d, 治疗三天,

与对照组相比,EPO 治疗组能明显减轻脑水含量、脑组织萎缩以及减少血肿体积。其机制 可能是减轻炎症性损伤,抑制 TNF-α 和 Fas 及其配体,抑制神经元凋亡。本实验也证实了

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EPO 可以减轻创伤引起的脑水肿。 烯醇化酶(Enolase)是细胞能量代谢活动中参与糖酵解过程的关键酶,以二聚体形式 存在于胞浆中,由α、β、γ三种亚基组成αα、ββ、γγ、αβ、αγ五种同工酶,其中γγ型烯醇化 酶特异地存在于神经元和神经内分泌细胞中故命名为神经元特异性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase, NSE)。正常情况下NSE仅存在于神经元和神经内分泌细胞内,所以 脑脊液和血清中含量甚微。 在神经元损伤后释放入脑脊液和血液中, 可以反映脑组织神经元 的损伤程度[14]。 本实验测定EPO治疗组24h后较对照组血清中NSE的含量明显降低, 说明EPO 对神经元具有保护作用;由于NSE释放入血首先需要通过血脑屏障,所以也反映血脑屏障较 完整。 我们用可重复的试验模型证实了腹腔注射EPO能明显减轻TBI的损伤程度,为EPO能早 日应用临床治疗脑外伤提供了实验依据。虽然多种试验均证实EPO具有神经保护作用,但是 目前还存在像临床用药最佳时间窗、 用药剂量以及会增加血液粘滞度等问题, 需要神经精神 疾病学者进一步的实验及临床研究。 美国威斯康星州正在针对中度颅脑损伤的病人进行EPO 第二阶段的临床试验治疗研究
[15]

,希望不久会出现令人满意的结果。

参考文献
1. Cherian L, Goodman JC, Robertson C. Neuroprotection with erythropoietin administration following controlled cortical impact injury in rats. J Pharmacol Exp Ther,2007,322:789-794. 2. Feeney DM, Boreson MG, Linn RT, et al. Responses to cortical injury: methodology and local effects of contusion in the rat. Brain Res,1981,211:67-77. 3. Baskawa MK, Dogan A, Rao AM, et al. Neuroprotective effects of citicotine on brain edema and blood-brain barrier breakdown after traumatic brain injury. Neurosurg, 2000,92:448-452. 4. Mathews K S, Mclaughlin D P, Ziabari L H, et al.Rapid quantification of ischaemic injury and cerebropro-tection in brain slices using densitometric assessment of 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride staining [J]. J Neurosci Methods, 2000,102:43-51. 5. Lu D, Mahmood A, Qu C, Goussev A, et al.Erythropoietin enhances neurogenesis andrestores spatial memory in rats after traumatic brain injury. J Neurotrauma, 2005,22:1011-1017. 6. Ozturk E, Demirbilek S, Kadir But A, et al. Antioxidant properties of propofol and erythropoietin after closed head injury in rats. Prog Neuropsychopharmacol boil Psychiatry. 2005,29:922-927. 7. Leist M, Ghezzi P, Grasso G, et al. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 2004,305:184-185. 8. D’Andrea RJ, Gonda TJ. A model for assembly and activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 receptors: insights from activated mutants of the common beta subunit. Exp Hematol, 2000,28:231-243. 9. Martine-Estrada OM, Rodriquez-Millan E, Gonzalez-De Vicente E, et al. Erythropoietin protects the in vitro blood-brain barrier against VEGF-induced permeability. Eur J Neurosci, 2003,18:2538-2544. 10. Keoqh CL, Yu SP, Wei L. The effect of recombinant human erythropoietin on neurovasculature repair after focal ischemic stroke in neonatal rats. J Pharmacol Exp Ther,2007,322:521-528. 11. Wang L, Zhang Z, Wang Y, et al. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats. Stroke, 2004,35:1732-1737. 12. Li Y, Lu Z, Keoqh CL, et al. Erythropoietin-induced neurovascular protection, angiogenesis, and cerebral blood flow restoration after focal ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab,2007,27:1043-1054. 13. Lee Soon-Tae, Chu Kon, Sinn Dong-In, et al. Erythropoietin reduces perihematomal inflammation and cell death with eNOS and STAT3 activations in experimental intracerebral hemorrhage. J Neurochemistry, 2006, 96:1728-1739. 14. Skogseid IM, Nordby HK, Urdal P, et al. Increased serum creatine kinase BB and neuron specific enolase following head injury indicates brain damage. Acta Neurochir (Wien), 1992,115:106-111. 15. Schouten JW. Neuroprotection in traumatic brain injury:a complex struggle against the biology of nature.Curr Opin Crit Care, 2007,13:134-142.

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The study of neuroprotection about erythropoietin on traumatic brain injury in rats
Yuan Ruizhi, Zhang Xinding, Feng Wei, Han Guang, Han Yanmin, Zhou Wangning, Cheng Junde, Feng Guangcai
Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou (730030) Abstract
Objective To explore the effectiveness of erythropoietin administration on blood-brain barrier, brain edema, injury volume and Neuron-specific enolase levels in serum after traumatic brain injury in rats. Methods Experimental traumatic brain injury was induced in rats by a weigth-drop model. 48 hours after injury extent of blood-brain barrier breakdown,brain water content,injury volume and 24hours after Neuron-specific enolase in serum was measured .Results blood-brain barrier breakdown was lower in erythropoietin group than in the control group. Brain edema was reduced in the erythropoietin group relative to the control group. Erythropoietin treatment reduced injury volume compared with control group. Neuron-specific enolase levels of serum is lower in erythropoietin group than in the control group. Conclusions Administration of erythropoietin reduced blood-brain barrier permeability, injury volume,brain edema and neuron damage. Keywords: Erythropoietin;Traumatic brain injury;Neuron-specific enolase

作者简介: 原睿智(1980-) ,男,在读硕士,主要从事颅脑外伤的基础与临床研究工作; 张新定,E-mail:zhangxinding@126.com。

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