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基因工程课件



基因工程的基本操作程序的步骤: 目的基因的获取

基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定

1、什么是目的基因? 2、获取目的基因的方法有哪些?其操 作过程分别是怎样的?

一、目的基因的获取
1、目的基因概念: 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也 可以是一些具有调控作

用的因子。 2、目的基因获取方法: 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法直接人工合成

从基因文库中获取目的基因
基因文库:

将含有某种生物不同基因的许多DNA 片断,导入到受体菌的群体中,各个 受体菌分别含有这种生物的不同基因, 称为基因文库。
基因文库 基因组文库 部分基因文库 (如cDNA文库)

基因文库的构建过程
基 因 组 文 库
限制酶

供体细胞的 全部DNA

大量DNA 片段 拼接到载体上

导入受体细胞扩增

基因文库的构建过程
mRNA
逆转录

单链DNA

双链DNA

cDNA文库

从基因文库中获取目的基因
如何从基因文库中找到所需要的基因? 依据目的基因的有关信息。 如:根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。

利用PCR技术扩增目的基因
PCR的全称: 聚合酶链式反应 PCR的原理: DNA复制 PCR技术扩增目的基因的前提条件: 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。

利用PCR技术扩增目的基因
PCR的条件: 模板 ——目的基因DNA

原料 ——四种脱氧核苷酸
引物 ——如单链DNA分子片段 酶 ——耐热的DNA聚合酶

控制温度 ——PCR仪自动调控

利用PCR技术扩增目的基因
PCR的过程:
变性(90-95℃)

复性(55-60℃)
延伸(70-75℃)

用化学方法直接人工合成
条件:基因较小,核苷酸序列已知。

二、基因表达载体的构建—核心
用切目的基因相 同的限制性内切 酶切割质粒

二、基因表达载体的构建—核心

二、基因表达载体的构建—核心
目的基因

二、基因表达载体的构建—核心
1、基因表达载体的组成 目的基因 启动子: 一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的首端。 终止子: 一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的尾端。 标记基因等

二、基因表达载体的构建—核心
启动子的作用:
是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才 能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质。

终止子作用: 使转录在所需要的地方停止。 标记基因作用:
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因,从而将有目的基因的细胞筛选出来, 如青霉素基因。

二、基因表达载体的构建—核心
2、基因表达载体的构建目的: a.使目的基因在受体细胞中稳定存在, 并且可以遗传给下一代。 b.使目的基因能够表达和发挥作用。

三、目的基因导入受体细胞
1、什么是转化? 2、目的基因导入植物细胞常用的方法 是什么?具体过程是怎样的? 3、目的基因导入动物细胞常用的方法 是什么?基本操作程序是怎样的? 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎 样的?钙离子有什么作用?

三、目的基因导入受体细胞
转化
目的基因进入受体细胞内,并且在受 体细胞内维持稳定和表达的过程。

三、目的基因导入受体细胞
1.目的基因导入植物细胞
常用的方法: 农杆菌转化法、基因枪法、花粉 管通道法 农杆菌的特点: a.易感染双子叶植物和祼子植物。 b.具有趋化性。 c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞, 并整合到受体细胞染色体的DNA上

三、目的基因导入受体细胞
1.目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法的导入过程: 构建基因表达载体
转入

农杆菌
导入

稳定维持和表达

植物细胞

三、目的基因导入受体细胞
2.目的基因导入动物细胞
常用的方法: 显微注射技术 操作程序: a.先提纯含目的基因的表达载体 b.从动物体内取出卵(受精卵) c.显微注射仪进行显微注射 d.将含目的基因的受精卵移植到输卵 管或子宫中发育成新个体

三、目的基因导入受体细胞
3.目的基因导入微生物细胞
原核生物的特点: 繁殖快,多为单细胞,遗传物质相对较 少。 大肠杆菌的转化过程: 增加细胞壁的透性,
与细胞膜无关 用Ca2+处理细胞 → 感受态细胞 感受态细胞吸收DNA分子

重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合

四、目的基因的检测与鉴定
1、导入目的基因后需要检测哪些方面? 各采取什么方法? 2、什么是DNA分子探针?检测时的DNA探 针通过什么原理来检测目的基因和相 应的mRNA? 3、利用抗体-抗原杂交检测的原理是什 么?

四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测内容和方法
1.目的基因是否插入受体细胞染色体的 DNA上 检测方法: DNA分子杂交技术
DNA探针: 用放射性同位素等作标记的含有 目的基因的DNA片段。

四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测内容和方法
2.目的基因是否转录出mRNA
检测方法: 分子杂交技术 用DNA探针与mRNA杂交。

四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测内容和方法
3.目的基因是否翻译出蛋白质 检测方法: 抗原—抗体杂交

四、目的基因的检测与鉴定
4、个体生物学水平的鉴定

思考与探究
β—珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成 成分,当它的成分异常时,动物可能患 某种疾病,如镰刀型细胞贫血症,假如 让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产 出鼠的β—珠蛋白,想一想,应该如何 设计?

思考与探究

1.从小鼠中克隆出β—珠蛋白基因的编码序列 (CDNA)。 2.将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子, 另外加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体。 3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然 后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表 达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗 四环素基因而死掉;如果培养基上长出了大肠杆菌 菌落,则表明β—珠蛋白基因已进入。 4.培养进入了β—珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌 体,破碎后从中提取β—珠蛋白。



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