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气相色谱中内标法与外标法的应用



一、内标法 1.什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。 在分析测定样品中某组分含量时, 加入一种内标物质 以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响,以提高分析结果的准确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时,在样品中加入一定量 的标准物质,它可被色谱拄所分离,又不受试样中其它组分峰的干扰,只要测定内标物和待 测组分的

峰面积与相对响应值, 即可求出待测组分在样品中的百分含量。 采用内标法定量时, 内标物的选择是一项十分重要的工作。 理想地说, 内标物应当是一个能得到纯样的己知化合 物,这样它能以准确、已知的量加到样品中去,它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽 可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和 响应特征,最好是被分析物质的一个同系物。当然,在色谱分析条什下,内标物必须能与样 品中各组分充分分离。需要指出的是,在少数情况下,分析人员可能比较关心化台物在一个 复杂过程中所得到的回收率, 此时, 他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台 物作内标,来测定感兴趣化合物的百分回收率,而不必遵循以上所说的选择原则。 2.在使用内标法定量时,有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方 面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括: 1、内标物在样品里混合不好; 2、内标物和样品组分之间发生反应, 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说,色谱方面的问题发生的可能性更大一些,色谱上常见的 一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大,对面积比的影响则要小一些,但如果绝对面积 的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度, 那么一定有某个重要的色谱问题存在, 比 如进样量改变太大,样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别,检测器非线性等。进样量 应足够小并保持不变,这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠, 而色谱固看来也是正常的话,应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发 生怀疑的最有力的证据是:面积比可变,而峰高比保持相对恒定, 3.在制作内标标准曲线时应注意什么? 在用内标法做色话定量分析时,先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色 谱分析,测量峰面积,做重量比和面积比的关系曲线,此曲线即为标准曲线。在实际样品分 析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致, 因此, 在制作标准曲线 时,不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等),还应注明进样体积和内标物浓度。 在制作内标标准曲线时, 各点并不完全落在直线上, 此时应求出面积比和重量比的比值与其 平均位的标准偏差,在使用过程中应定期进行单点校正,若所得值与平均值的偏差小于 2, 曲线仍可使用,若大于 2,则应重作曲线,如果曲线在铰短时期内即产生变动,则不宜使用 内标法定量。 二、外标法 用待测组分的纯品作对照物质,以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定 量的方法称为外标法。 此法可分为工作曲线法及外标一点法等。 工作曲线法是用对照物质配 制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线,求出斜率、截距。在完全相同的条件下,准确进

样与对照品溶液相同体积的样品溶液,根据待测组分的信号,从标准曲线上查出其浓度,或 用回归方程计算,工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零,若不等于零说明 存在系统误差。工作曲线的截距为零时,可用外标一点法(直接比较法)定量。 外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中 i 组分的含量。将对照品溶 液与样品溶液在相同条件下多次进样, 测得峰面积的平均值, 用下式计算样品中 i 组分的量: W=A(W)/(A) 式中 W 与 A 分别代表在样品溶液进样体积中所含 i 组分的重量及相应的峰面积。(W)及 (A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品 i 组分的重量及相应峰面积。外标法方法简 便,不需用校正因子,不论样品中其他组分是否出峰,均可对待测组分定量。但此法的准确 性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外,为了降低外标一点法的实验误差,应尽量 使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法,它不是把标准物质加入到被测样品中,而是在与被测样品 相同的色谱条件下单独测定, 把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被 测组分的含量。 外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度, 分析时外标物的浓 度应与被测物浓度相接近,以利于定量分析的准确性。 三、定量分析中怎样选择内标法或外标法(来源:药物分析网) 选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(当然是样品中没有的组分) ,然后 配制欲测组分和内标物的混合标准溶液, 进样得相对校正因子。 再将内标物加入欲测组分的 样品中,进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。 内标法是将一定量的纯物质作内标物,加入到准确称量的试样中,根据被测试样和内标 物的质量比及其相应的色谱峰面积之比,来计算被测组分的含量。 选择内标物有四个要求:1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;2.它必须完全溶于试 样中,并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;3.加入内标物的量应接近于被测组分;4.色 谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近,或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的优点是测定的结果较为准确,由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对 值来进行计算的, 因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。 内标法的缺点 是操作程序较为麻烦, 每次分析时内标物和试样都要准确称量, 有时寻找合适的内标物也有 困难。 外标法简便,但进样量要求十分准确,要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行, 否则造成分析误差,得不到准确的测量结果。 内标与外标都是定量的一种方法而已,至于哪一种方法好与不好不能一概而论,做不同 的分析,面对着不同的要求,再加上分析成本分析效率等等问题,我想简单而有效进行定量 分析来满足要求才是最重要的。 1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析,没有自动进样器, 用外标法定量,确实重现性与稳定性非常差,结果经常受到搞合成同事的质疑。其实,仔细 分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析, 首先我们的实验室仪器和手段是否调整到 一种稳定而合理的状态了,比如,衬管是否洁净,玻璃棉的位置是否合适恰当(能否使样品 尽可能的汽化) 、汽化温度是否合适、色谱峰形是否对称(也就是样品与色谱柱健合相是否 匹配) 、附近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式(如快速进样还是热针进样)等 等因素的影响都需要考虑, 如果这些因素都考虑了, 按照 GMP 方法验证对于精密度的要求, 同一样品进 6 针以上的 RSD 和配制 6 个样品的定量结果 RSD 都能满足小于 1.5%的要求, 那么这个方法用外标法就是完全适用的, 但是前面的影响因素是一定要都考虑到的, 否则谈

论这个方法是否适用就有失偏颇了。 在做过的许多出口产品的定量分析方法当中有许多是一 些医药公司提供的比较完善而验证过的方法,内标与外标都有(他们用的都是自动进样)精 密度都能满足 RSD 小于 1.5%的要求, 当一个方法能够满足测试要求的时候, 无论内标外标, 都是可行的,当然有一个分析成本和分析时间的问题,内标的成本和控制溶液、样品溶液的 配制当然要比外标要高和麻烦一些了。 而有些时候, 可能受你实验室现有仪器和附属设备的 影响, 达不到一定的要求, 而还必须进行定量分析, 有时外标的结果可能就要差一些, 这时, 你可能就要考虑用内标法了,可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因 素平行误差的影响,这时内标可能就显示出它的优势来了。 2、上面已经提到当做方法验证的时候,当同一样品配制 6 个样品溶液用所选用的外标法进 行定量的时候, RSD 都满足 1.5%的要求时, 也分为两种情况, 小于 1%和大于 1%小于 1.5%。 如果 RSD 的结果小于 1%, 那这个方法就没有什么可以怀疑的了; 如果 RSD 的结果大于 1% 而在 1.5%略低一些的范围活动时,这个方法的可行性就将受到质疑,毕竟这是方法验证, 你就要考虑上面 1 所提到的影响因素的影响了,如果排除掉以上的影响因素,RSD 还是在 1.5%附近,就要尝试内标了,如果内标结果的 RSD 很好,就证明你的这个方法受实验条件 的影响很大,只能用内标了,或者干脆将原方法做大的变动,再尝试用外标法测试。 3、而对于微量分析,比如农药和兽药残留的分析、环境分析等,根据不同的限量标准要求 对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多, RSD 有时可以允许达到 10%甚至更高, 这时可能外标法有更大的应用空间。 4、单从精密度方面去考虑,排除其它成本和效率的因素,个人认为还是内标优于外标。曾 经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析,以二乙醇胺为内标,RTX-5 amine(碱改性) 15m*0.32mm*1.0um 色谱柱分析,将配制好的控制溶液(含有内标物)自动进 样器进 6 针,目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的 RSD 为 0.18%, 而只对这六针样品的目的物峰(二氨基丙醇)面积求 RSD,结果为 0.71%,通过这一实例 的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了, 当然是内标更好了。 当然这个化合物的检 测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的, 实验室可以自由选择。 但内 标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。 结论:应用外标法能够满足要求,首选还是外标法了,毕竟简单而省事。对于精密度要求比 较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下,用内标法还是必 要的。无论应用那种方法,方法的验证和确认都是很重要的,只要是按照程序经过验证和确 认的方法,都有其应用的空间的。

外标使用标准品做工作曲线,来校正样品。内标, 史家如何测试成分, 相近的成分, 用 代测品在不同浓度下和内标之间的关系。 但是如果没有标准品,不能定出代测物的绝对量 外标法是通过做标准曲线来定量的, 内标是一种能够确定你的样品就是你要测的成分, 是一 种辅助的间接定性的作用。 如果是要定量的话,做气质连用通过峰高和峰面积可以粗略的 定量,通过质朴扑图库可以查出各个成分的组成,这样就既定性了也粗略的定量了,要是要 更准确的定量的话也是做标准曲线,但是可以选择 SIM 扫描,这样做的灵敏度更高,呵呵, 我也是刚接触没多久,尽我所能了。



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