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植物组培教案



《植物组织培养》

主编:傅鸿达 副主编:谢阳军 编者:陈香秀

前言 自 1902 年德国著名植物学家 Haberlandt 首次进行高等植物的组织培养实 验,并提出植物细胞全能性理论以来的 100 多年中,经许多学者不懈地努力, 植物组织与细胞培养技术得到了蓬勃发展。已渗透到生物学科的各个领域,成 为生物工程技术中的一个重要组成部分和

基本研究手段之一,为快速繁育优良 品种、培育无毒苗木、进行突变筛选培育、药用植物工厂化生产、种质保存和 基因库建立等方面开辟了新途径。并广泛应用于农业、林业、工业和医药业, 产生了巨大的经济效益和社会效益,成为当代生物科学中最有生命力的领域之 一。尤其是快繁技术和无毒苗培育技术,在农林业生产中具有重大的实践意义。 同时,由于植物组织与细胞培养技术在单倍体育种、原生质体融合和基因工程 植物的再生和培养中起着重要的作用,因此它为现代农业生物技术的发展提供 的坚实的基础。 随着植物组织培养和分子生物学技术的不断进步,1983 年首次获得了转基 因植物,植物基因工程和分子标记辅助育种等新技术于是得到迅速发展和广泛 应用,并形成了一个具有无限活力的新领域——植物生物技术。 我国是一个农业大国,目前从事植物组织培养的人数和实验室总面积,均 居世界第一。试管繁殖虽取得了一定成绩,但经济效益还不是很高,发展不够 平衡。究其原因,主要是缺乏技术人才,经营和管理不善,急需培养这方面的 高级技术应用人才和管理人才,因此,农业人才的培养也应由传统学科向植物 科学技术专业转变,让新兴学科向传统专业渗透,以适应农业现代化的需要。 植物生物技术是中等职业学校农林专业和生物科学等相关专业的一门重要 的专业基础课或选修课,但课时有限,因此本书在编写过程中,在力求新颖的 同时,特别注重基础知识、基本理论和技能的概述,希望它能成为一本真正适 应中等职业学校教学的教材。全书分为植物组织与细胞培养、植物基因工程和 植物生物技术实验三走部分,各部分内容相互衔接形成统一整体。 编写中,以中等职业技术教育的能力领域和岗位技能为依据,以适应农村 和城市经济发展需求为目标,以应用为主旨,以强化技术应用能力为主线,以 中职教学目标为切入点,以必需、够用、管用、实用为度,讲清基本理论、基 本知识和基本技能,优化了技能教育结构。本着“怎样做就怎样讲”的精神精 选教学内容,加大了实践教学的比重和力度,使之更贴近生产。 为使教学过程体现以学生为主体、以教师为主导,教材中适当安排了讨论 课并在每个单元后都列出数量适当、难度适宜、联系生产实际、具有综合性和 启发性的复习思考题,以激发学生学习的主动性,培养学生的创新能力。 本教材参阅了大量国内外文献,在此我们也向这些文章的作者致以衷心的 谢意。 由于时间仓促,编者水平有限,书中难免有不当及错误之处,恳请同行和 读者批评指正,以便修订。 编者 2013 年 4 月

目录 教学目的及课时安排???????????????????1 第一章概述??????????????????????? 第一节植物组织培养的概念?????????????? 第二节植物组织培养的发展?????????????? 第三节植物组织培养的应用?????????????? 第二章植物组织培养实验室的构建和操作技术???????? 第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 第二节培养基及其配制???????????????? 第三节外植体的选择与培养?????????????? 第四节试管苗的驯化与移栽????????????? 第五节快速繁殖工作的计划安排???????????? 第三章愈伤组织培养?????????????????? 第一节 愈伤组织培养的诱导与分化?????????? 第二节 愈伤组织的继代培养?????????? 第三节 愈伤组织的形态发生?????????? 第四节 愈伤组织培养的应用?????????? 第四章器官培养????????????????????? 第一节根的培养??????????????????? 第二节茎尖的培养?????????????????? 第三节叶的培养??????????????????? 第五章胚胎培养????????????????????? 第一节胚培养???????????????????? 第二节胚乳培养??????????????????? 第三节胚珠和子房培养???????????????? 第六章花药和花粉培养?????????????????? 第一节花药和花粉培养技术?????????????? 第七章原生质体的培养?????????????????? 第一节原生质体的分离与纯化????????????? 第二节原生质体培养????????????????? 第三节原生质体融合????????????????? 第八章植物脱毒技术??????????????????? 第一节脱毒方法??????????????????? 第二节脱毒苗鉴定?????????????????? 第三节无病苗的保存和繁殖?????????????? 第九章常见植物的脱毒与快速繁殖技术??????????? 第一节花卉植物的组织培养?????????????? 第二节水果作物的组织培养?????????????? 第十章组培苗工厂化生产的经营与管理??????????? 第一节 商业化经营管理???????????????? 第二节生产规模与生产计划??????????????? 第三节成本核算与效益分析??????????????? 第四节 降低成本提高效益的措施????????????

第十一章种质保存???????????????????? 第一节 种质资源保存的一般概念???????????? 第二节 低温保存????????????????????? 第三节 超低温保存???????????????????? 植物组培综合训练课程说明??????????????????

教学目的及课时安排 一、教学目的及要求 植物组织培养是在无菌条件下,利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞 和原生质体进行培养的技术, 是现代生物技术的核心技术之一。在植物的优良品 种快速繁殖、脱毒苗木生产、缩短育种进程、种质资源保存等方面具有其它技术 无法比拟的优势。 通过教学让学生了解植物组织培养的发展概况、未来发展趋势 及在生产实践中的应用。了解重要植物(10—15 种)组培快繁与脱毒技术及组 培苗工厂化生产与经营管理。 了解组织培养中污染、褐变及超度含水态苗发生的 原因及控制措施。理解植物组织培养的基本原理。掌握植物器官、愈伤组织、胚 胎、花药与花粉、细胞、原生质体培养及种质资源保存的基础技术。掌握植物组 培快繁及脱毒苗培育技术。熟知外植体初代培养、诱导增殖、壮苗与生根及瓶苗 驯化等各技术环节。 二.内容与课时安排(124 学时,下划线为教学重点,*为教学难点) 1. 概述(8 学时) 1.1 植物组织培养的概念 1.2 植物组织培养的发展 1.3 植物组织培养的应用 实验一、组培实验室的整理、灭菌和培养容器的清洗 2. 植物组织培养实验室的构建和操作技术(20 学时) 2.1 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 2.2 培养基及其配制 2.3 外植体的选择与培养 2.4 试管苗的驯化与移栽* 实验二、MS 培养基母液配制与保存 实验三、培养基配置 3. 愈伤组织培养(10 学时) 3.1 愈伤组织培养的诱导与分化 3.2 愈伤组织的继代培养 3.3 愈伤组织的形态发生* 3.4 愈伤组织培养的应用 实验四、胡萝卜离体根的培养 4. 器官培养(10 学时) 4.1 根的培养 4.2 茎尖的培养 4.3 叶的培养 实验五、非洲菊茎段培养 5. 胚胎培养(4 学时) 5.1 胚培养 5.2 胚乳培养 5.3 胚珠和子房培养 6. 花药和花粉培养(8 学时) 6.1 花药和花粉培养技术 6.2 花药和花粉培养的应用 实验六、草莓花药培养

7、原生质体培养和体细胞杂交(6 学时)* 7.1 原生质体的分离与纯化 7.2 原生质体培养 7.3 原生质体融合* 实验七、生根培养 8、植物脱毒技术(6 学时) 8.1 脱毒方法 8.2 脱毒苗鉴定* 8.3 无病毒苗的保存和繁殖 9、常见植物的脱毒与快繁技术(30 学时) 9.1 花卉植物的脱毒与快繁 9.2 药用植物的脱毒与快繁 9.3 园林树木的脱毒与快繁 实验八、百合鳞茎培养 实验九、组培苗的移栽与驯化 10、组培苗工厂化生产的经营与管理(8 学时) 10.1 商业化经营管理 10.2 生产规模与生产计划 10.3 成本核算与效益分析 10.4 降低成本提高效益的措施 实验十、组培苗工厂化生产的厂房工艺流程设计 11、种质保存(4 学时) 11.1 种质资源保存的一般概念 11.2 低温保存 11.3 超低温保存 三、教材及参考资料 教材:王清连.《植物组织培养》 ,北京:中国农业出版社,2001 崔德才,徐培文.组织培养与工厂化育苗.北京:化学工业出版 社,2004 参考资料: [1] 程文广.名优花卉组织培养技术。北京:科学技术文献出版社,2001 [2] 杨增海.园艺植物组织培养。北京:农业出版社,1987 [3] 李浚明编译.植物组织培养教程。北京:北京农业大学出版社,1996 [4] 潘瑞炽.植物组织培养。广州:广东高等教育出版社,2000 [5] 中科院上海植生研究所编、植物组织和细胞培养,上海:上海科学技术 出版社,1987 [6] 颜敬吕等,植物组织培养手册。上海:上海科学技术出版社,2001 [7] 曹孜义等,实用植物组织培养教程。兰州:甘肃科学技术出版社,2000 [8] 潭文澄、戴策刚等.观赏植物组织培养。北京:中国林业出版社,2000 [9] 陈振光.园艺植物离体培养学。北京:中国农业出版社。 [10] 陈正华.木本植物组织培养及其应用。北京:高等教育出版社,1986 [11] 孙敬兰等.植物细胞工程实验技术。北京:北京科学出版社,1995 [12] 顾淑荣等.园艺植物组织培养及应用。 北京: 北京科学技术出版社, 1989

第一章

概述

[目的要求] 明确植物组织培养的概念, 掌握植物组织培养的原理,了解植物组织培养的 发展及应用。 [知识模块] 概述——组织培养概念、原理、发展、应用 [教学重点] 植物组织培养概念及其在快速繁殖与脱毒方面的应用 [教学难点] 植物细胞全能性及植物组织培养的基本流程 [教学方法] 借助多媒体课件进行讲授,借助组织培养中心及多功能温室实地参观 第一节 植物组织培养的概念 高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或 植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养,是 指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体 explant),接种到培养基上,在 人工控制的条件进行培养, 使其生成完整的植株。组织培养按培养对象可分为植 株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等 (1)植株培养(plant culture)是对完整植株材料的培养,如幼苗及较大 植株的培养。 (2) (器官培养(organculture)即离体器官的培养, 根据作物和需要的 不同,可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、 雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养 (3) 组织或愈伤组织培养(tissue。rcallusculture)为狭义的组织培 养, 是对植物体的各部分组织进行培养,如茎尖分生组织、形成层、木质部、 韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等;或对由植物器官培养产生的 愈伤组织进行培养,二者均通过再分化诱导形成植株。 (4) 细胞培养 (cellculture) 是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得 到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。 (5) 原生质体培养 (proplastculture) 是用酶及物理方法除去细胞壁 的原生质体的培养。 组织培养是本世纪发展起来的一门新技术,由于科学技术的进步,尤其是外 源激素的应用, 使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据,而 且一跃成为一种大规模、 批量工厂化生产种苗的新方法,并在生产上越来越得到 广泛的应用。 植物组织培养之所以发展如此之快,应用的范围如此之广泛,是由于具备 以下几个特点: ①培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件 下进行生长,摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响,且 条件均一,对植物生长极为有利,便于稳定地进行周年培养生产。 ②生长周期短,繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件, 根据不同植物不同部位的不同要求

而提供不同的培养条件,因此生长较快。另外,植株也比较小,往往 20-30d 为 一个周期。所以,虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗,但由于植物材料 能按几何级数繁殖生产, 故总体来说成本低廉,且能及时提供规格一致的优质种 苗或脱病毒种苗。 ③管理方便,利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下, 人为提供一定的温度、 光照、 湿度、 营养、激素等条件,极利于高度集约化和高密度工厂化生产,也利于自动化控制 生产。 它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去 了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动,可以大大节省人力、物 力及田间种植 所需要的土地。 第二节 植物组织培养的发展 组织培养技术的蓬勃发展只是近 50 年的事,但它的整个历史可以追溯至 19 世纪末和上世纪初。20 世纪初,在 Schleiden 和 Schwann 所发展起来的细胞学 说的推动下,1902 年德国植物学家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和组织为 许多细胞组成的观点,以及植物细胞全能性的理论,即植物的体细胞,在适当的 条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物 离体细胞培养实验的报告。1912 年,Habefiandt 的学生 Kotte 和美国的 Robins 在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte 采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、 天冬酰胺,及添加各种氨基酸的培养基。Robins 用含无机盐、葡萄糖或果糖的 琼脂培养基,培养了长度为 1.45-3.75cm 的豌豆、玉米和棉花的茎尖,形成了一 些缺绿的茎和根。 自 Haberlandt 的实验之后,直到 1934 年美国的 White 由番茄根建 立了第一个活跃生长的无性繁殖系,并反复转移到新鲜培养基中继代培养,使根 的离体培养实验获得了真正的成功,并在以后 28 年间培养了 1600 代。这之后, White 又以小麦根尖为材料,研究了光、温度、通气、pH 值、培养基组成等各种 培养条件对生长的影响,并于 1937 年建立了第一个组织培养的综合培养基,其 成分均为已知化合物,包括 3 种 B 族维生素,即吡哆醇、硫胺素和烟酸,该培养 基后来被定名为 White 培养基。与此同时,Gautherer(1934)在研究山毛柳和黑 杨等形成层的组织培养实验中, 提出了 B 族维生素和生长素对组织培养的重要意 义,并于 1939 年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年,White 由烟草 种间杂种的瘤组织, Nobecourt 由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组 织培养物。因此,Gautherer,White 和 Nobecourt 一起被誉为组织培养学科的 奠基人。 我们现在所用的培养方法和培养基, 基本上都是由这三位科学家建立的。 后来,White 于 1943 年发表了《植物组织培养手册》专著,使植物组织培养开 始成为一门新兴的学科。 40 年代 Skoog 和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现, 腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(1AA)对芽形成的抑制作用,而能诱导形 成芽, 从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即 这一比例高时,产生芽;这一比例低时,则形成根;相等则不分化。在寻找促进 细胞分裂的物质过程中,Miller 等人于 1956 年发现了激动素。不久即知道激动 素可以代替腺嘌呤促进发芽, 并且效果可增加 3 万倍。结果上述控制器官分化的 激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现,有力地推动了植 物组织培养的发展。

1952 年,Morel 和 Martin 通过茎尖分生组织的离体培养,从已受病毒侵染 的大丽花中首次获得无病毒植株。1935-1945 年 Muir 把单细胞放在一张铺在愈 伤组织上面的滤纸上培养,使细胞发生了分裂,即实施了看护接种技术, ,使单 细胞培养获得初步成功。 1960 年,Cocking 等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971 年,Takebe 等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株,这不仅在理论上证明 了无壁的原生质体同样具有全能性, 而且在实践上为外源基因的导入提供了理想 的受体材料。80 年代中期以来,对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷,在 这方面中国学者做出了重要贡献。1962 年印度 Guha 等人成功地在毛叶曼陀罗花 药培养中,由花粉诱导得到单倍体植株,从而促进了花药和花粉培养的研 究。 以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物 培养中获得成功,其数目达到 160 多种,其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培 养在中国取得了引入注目的成就。 1960 年,Morel 提出了一个离体无性繁殖兰花的方法,其繁殖系数极高。由 于这一方法有很大的应用价值, 很快被兰花生产者所采用, 迅速建立起兰花工业。 1973 年 Carlson 等通过两个烟草物种之间原生质体融合,获得了第一个体细胞 杂种,Cocking 等倡导的原生质体培养和体细胞杂交,研究得到了迅速发展,已 经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。 在整个植物组织培养发展的历史中,我国学者做出多方面的贡献,除了前述 的崔徵的研究成效以外,还有 1993 年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的 研究工作,以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养,李正理关于离体胚的研究培养、王 伏雄等关于幼胚的研究培养工作。 第三节 植物组织培养的应用 植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域, 除了在基础理论的研究上占有 重要地位以外,还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。 一、快速繁殖种苗(rapidpropagation) 用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用, 包括花卉观赏植 物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制, 生长周期短,而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。 快速繁殖可用下列手段进行:通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽;通 过根、叶等器官直接诱导产生不定芽;通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管 快速繁殖应用在下列生产或研究中:(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种,以 及保存自交系、不育系 等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生 产上急需的或种源较少的种苗。 由于组织培养周期短,增殖率高及能全年生产等 特点, 加上培养材料和试管苗的小型化, 这就可使有限的空间培养出大量的植物, 在短期内培养出大量的幼苗。 组织培养突出的优点是"快",通过这一方法在较短 时期内迅速扩大植物的数量, 以一个茎尖或一小块叶片为基数,经组织培养一年 内可增殖到 10 000-100 000 株。 二、无病毒苗(virus free)的培养 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害, 有的种类甚至同

时受到数种病毒病的危害, 尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖,若蒙受病毒 病,代代相传,越染越重,甚至会造成极严重的后果。自从 Morell952 年发现采 用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后, 微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要 途径之一。若再与热处理相结合,则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物,茎 尖培养得到的植株难以发根生长,则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒 苗。 组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用,如马铃薯, 甘薯,草莓,苹果,香石竹,菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产 中心,这 对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究,形成了一个 规范的系统程序,从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。 三、在育种上的应用(breeding) 植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法,使育种工 作在新的条件 下更有效的进行。 如用花药培养单倍体植株;用原生质体进行个体细胞杂交和基 因转移;用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精,以及种质资源的保存 等等。 胚培养技术很早就有利用, 在种属间远缘杂交的情况下,由于生理代谢等方 面的原因,杂种胚常常停止发育,因此不能得到杂种植物,所以通过胚培养就可 保证远缘杂交的顺利进行。到 50 年代在实践上的应用就更多了,如在桃、柑橘、 菜豆、南瓜、百合、鸢尾等等许多园艺植物远缘杂交育种上都得到了应用。大白 菜 X 甘蓝的远缘杂交种"白兰", 就是通过杂种胚的培养而得到的。对早期发育幼 胚因太小难以培养的种类, 还可采用胚珠和子房培养来获得成功。利用胚珠和子 房培养也可进行试管受精, 以克服柱头或花柱对受精的障碍,使花粉管直接进入 胚珠而受精。 花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺 葵等约 20 种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经过 多代自交,而单倍体育种,经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体,大大缩 短了育种的世代和年限。 利用组织培养可以进行突变体的筛选。突变的产生因部位而异,茎尖遗传性 比较稳定,根、茎、叶乃至愈伤组织和细胞的培养则变异率就较大。培养基的激 素也会诱导变异,因浓度而不同。此外还可采用紫外线、x 射线、Y 射线对材料 进行照射, 来诱发突变的产生。 在组织培养中产生多倍体、 混倍体现象的比较多, 产生的变异为育种提供的材料,可以根据需要进行筛选。利用组织培养,采用与 微生物筛选相似的技术,在细胞水平上进行突变体的筛选更加富有成效。 原生质体培养和体细胞杂交技术的开发,在育种上展现了一幅崭新的前景。 已有多种植物经原生质体培养得到再生植物,有些植物得到体细胞杂种,无论在 理论和实践上都有重要价值。 随着这方面工作的深入和水平的提高,原生质体培 养一定会在育种上产生深远的影响。 四、工厂化育苗(industrializing propagation) 近年来, 组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段,在园艺 植物的生产领域蓬勃发展。 组织培养育苗工厂化生产, 是以植物组织培养为基础, 在含有 植物生长发育必需物质的人工合成培养基上,并附加一定量的生长调节 物质, 把脱离于完整植株的本来已经分化的植物器官或细胞,接种在不同的培养

基上。在一定 的温度、光照、湿度及 pH 值 条件下,利用细胞的全能性以及原 有的遗传基础,促使细胞重新分裂、分化长成新的组织、器官或不定芽,最后长 成和母株同样的小植物体。例如非洲紫罗兰组织培 养育苗的工厂化生产,就是 取样品株一定部位的叶片为材料,消毒后切成一定大小的块,接种在适宜的培养 基上,在培养室内培养,两个月左右在切口处产生不定 芽,这些不定芽再切割 后又形成新的不定芽,如此继续,即可获得批量的幼小植株,按需要量生产与样 品株完全相同的苗子。 工厂化生产组织培养育苗, 是按一定工艺流程和规范化程序生产的,不但具 有繁殖速度快、整齐、一致、无虫少病、生长周期短、遗传性稳定的特点,而且 还可以加 速产品的发展,获得繁殖无性系。特别是对一些繁殖系数低、杂合的 材料有性繁殖优良性状易分离、或从杂合的遗传群体中筛选出表现型优异的植 株,需要保持其优 良遗传性,有更重要的作用。另外,组织培养育苗的无毒化 生产,还可减少病害传播,更符合国际植物检疫标准的要求,扩大产品的流通渠 道,增加产品市场的销售 能力,同时可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响,缓 和淡、旺季的供需矛盾。 世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从 60 年代就已经开 始,并随着生长、分化规律性探索的逐步深化,到了 70 年代仅花卉业就已在兰 花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上 建立起大规模试管苗商品化生产,到 1984 年世界花卉幼苗产业的生产总值已达 20 亿美元, 其中美国花卉幼苗市场总值为 6 亿多美元, 日本三友种苗公司有 60% 的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985 年仅兰花一项,在美国注册的公司就有 100 余家,年销售额在 1 亿美元以上。由于组织培养技术的应用,加快了花卉新品种 的推广。以前靠常规方法推广一个新品种要几年甚至十多年,而现在快的只要 1-2 年就可在世界范围内达到普及和应用。 我国采用快速繁殖技术, 也使优良品种达到迅速的推广和应用。如广东切花 菊"黄秀风"的应用,使菊花变大,长势加强,花色鲜艳,抗病力增强,打开了进 入香港市场的渠道,使 30 多种观叶植物的推广很快遍及全国,丰富了人们的生 活, 并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化,培养了一批园林垂直绿化的 材料,促进了园林业的发展。植物 组织培养也存在一定的困难,首先是繁殖效 率与商品需要量的矛盾, 有些作物由于繁殖方法尚未解决,因而无法满足生产的 需要,其次是在培养过程中如何减少变异 株的发生。更重要的是应降低组培苗 工厂化生产的成本,只有降低成本,才能更好的投产应用。 总之, 随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用,使这一技 术在遗传育种、 品种繁育等方面表现出了巨大的潜力,特别是生物工程和工厂化 育苗实施以后,它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。 本章小结: (1)植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分,在人工配 制的培养基上进行培养,使之长成一株完整植物体的过程。 (2)按照外植体的不同,组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、 细胞培养和原生质体培养 5 种类型。 (3)组织培养具有:培养条件可以人为控制;生长周期短,繁殖率高;管 理方便,利于工厂化生产的突出特点,因而发展迅速。 (4)组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面:快速繁 殖优良苗木;获得脱毒苗;育种上应用;工厂化育苗。

复习思考题 (1)什么是广义的植物组织培养?什么是狭义的植物组织培养? (2)什么是"外植体"? (3)按照外植体的不同,植物组织培养可以分成几类?比较常用的是哪些? (4)植物组织培养有哪些特点? (5) 你认为植物组织培养技术在当前的农业生产上有什么价值 ? 为什 么? 第二章 植物组织培养实验室的构建和操作技术 目的要求: (1)掌握组织培养实验室的设计; (2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法; (3)掌握调控组织培养的主要环境条件。 (4)掌握灭菌和消毒的区别; (5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程; (6)掌握无菌接种的步骤; (7)掌握外植体的培养方法和步骤; (8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法; (9)掌握试管苗驯化的基本程序; (10)一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算法。 在进行植物组织培养工作之前, 首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件 有个全面的了解,以便因地制宜地利用现有房屋,或新建、改建实验室。实验室 的大小取 决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的,实验室规模太小,则 会限制生产,影响效率。在设计组织培养实验室时,应按组织培养程序来设计, 避免某些环节倒 排,引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下 进行的。要做到无菌的条件,需要一定的设备、器材和用具,同时还需要人工控 制温度、光照、湿度等 培养条件。 第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 一个标准的组织培养实验室应当包括:洗涤室、配置室、无菌室、培养室、 观察室等。在实际中可结合可行条件,合并一部分。 一、洗涤室(cleaning room) 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、 干燥和贮存。 室内应配备大型水槽, 最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿,可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑 料筐,用于运输培养器皿。备有干燥架,用于放置干燥涮净的培养器皿。 二、准备室(repairing room) 准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清 洗与整理工作。如果房间较多,可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室 专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作; 配置室则负责培养基的配制、 分装、 包扎和高压灭菌等工作。 为完成培养基的制备工作,准备室还应配备以下仪器设备: (1)大型工作台 其高度应方便配制工作。 (2)药品柜 用于放置常用药品。 (3)普通冰箱 主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物

材料等。 (4)电子分析天平和托盘天平 电子分析天平, 用于称取大量元素、 微量元素、 维生素、激素等微量药品精确度为 0.0001g;托盘天平用于称取用量较大的糖和 琼脂等,其精确度为 0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。 (5)电蒸馏水器 电蒸馏水器,采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母 液或培养基,配制培养基可用自来水来代替,若实验要求严格的话,则须用蒸馏 水。 (6)磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质,如各种化学物质、琼 脂粉等。磁力搅拌器还可加热,使之更利于溶解。 (7)恒温水浴锅 恒温水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。 (8)电炉或电饭锅 电炉的功率为 1500 或 2000W,并配有铝锅。电饭锅的功 率 1000W,用于琼脂的溶化。 (9)酸度计 组织培养中培养基 pH 值的准确度是十分重要的,应当使用酸度 计,若无酸度计,也可使用 pH 试纸进行粗测。 首次使用酸度计前,应用标准液调节定位,然后固定。测量 pH 值时,待测 液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高,测量时要调整 pH 值计上的温度扭 使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极,用后电极应用蒸馏水冲洗净,盖 上电极帽。 (10)培养基分装设备 小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用 医用"下口杯"作为分装工具, 在"下口杯"的下口管上套一段软胶管,加一弹簧止 水夹,使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时,可考虑采用液体自动定量 灌注设备。 (11)高压灭菌锅 用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用 小型手提式高压灭菌锅。 如果是连续的大规模生产,应选用大型立式的或卧式的 高压灭菌锅。通常以电作能源。 (12)恒温培养箱 用于植物材料的培养,其内有温度感受器,控制箱内温度 到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。 (13)烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿,也可用于干热灭菌和测定干物重。用 于干燥需保持 80-100℃;进行干热灭菌需保持 150℃,达 1-3h;若测定干物重, 则温度应控制在 80℃烘干至完全干燥为止。 三、接种室(transfering room) 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。 其无菌 条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。 在工作方便的前提下,接种室宜小不宜大,一般 7-8m2,要求地面、天花板 及四壁尽可能密闭光滑,易于清洁和消毒。配置拉动门,以减少开关门时的空气 扰动。 接种室要求干爽安静,清洁明亮。在适当位置吊装 1-2 盏紫外线灭菌灯,用 以照射灭菌。最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外 界空气对流。 接种室应设有缓冲间,面积 2m2 为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋,以 减少进出时带人接种室杂菌。 缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯, 用以照射灭菌。 接种室的主要设备及用具有: (1)接种箱 在投资少的情况下,可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密

闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制,准备时间 长,工作效率低。 (2)超净台 cleaning table 优点是操作方便自如,比较舒适,工作效率高, 准备时间短。开机 10 分钟即可操作,可进行长时间使用。在工厂化生产中,接 种工作量很大,需要经常长久地工作时,超净台是很理想的设备。超净台功率在 145-260W 左右,它装有小型鼓风机,使空气穿过一个前置过滤器,在这里把大 部分空气尘埃先过滤掉, 然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器,它除去了大 于 0.3um 的尘埃、细菌和真菌孢子等,最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净 空气的流速为每分钟 24-30m,这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染,这样 的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作, 就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 超净台分水平式和垂直式二种 型号。 (3)解剖镜 种类较多, 用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜 在分离茎尖等较小组织时,便于观察、操作,通常放大 5-80 倍。放大 40 倍以上 操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作,要有照明装置。解剖镜 上带有照相装置,根据需要随时对所需材料进行摄影记录。 (4)无菌操作用的器具 按单人超净台上用量有:酒精灯 1 个;20-25cm 长的 医用镊子 1 把;4 号解剖刀 1 把,解剖刀片若干;15cm 医用剪 1 把;250ml 广口 瓶 1 只,内放酒精,用于浸泡镊子、刀、剪等;用于架放灼烧过的刀、镊子的小 架。 四、培养室(culturing room) 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。 培养室的大小可根据需要培养 架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原 则。高度比培养架略高为宜,周围墙壁要求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成,一般 设 5 层,最低 一层离地高约 lOcm,其他每层间隔 30cm 左右,培养架即高 1.7m 左右。培养架 长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用 40W 日光灯,则长 1.3m,30W 的长 lm,宽度一般为 60cm。 培养室最重要的因子是温度,一般保持在 20-27℃左右,具备产热装置,并 安装窗式或立式空调机。 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度,最 好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在 70 % -80%为好,可安装加湿器。 控制日光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照 10-16h 也有的需要 连续照明。短日照植物需要短日照条件,长日照 植物需要长日照条件。现代组 培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源, 而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 五、设备和器材 (一) 、 玻璃器皿 在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。 要求由碱性溶解度 小的硬质玻璃制成, 以保证长期贮存药品及培养的效果;培养用的还要求透光度 好,能耐 高压高温,能方便放人培养基和培养材料的器皿,根据培养的目的和 要求,可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使

用较多。 最常使用的是三角瓶,规格有 l00ml,250ml,500ml 等,一般使用 l00ml 三角瓶,无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大,利于组织生长,受光也比 试管好。由于瓶口较小,亦不易污染。 培养皿常用 9、12cm 直径等规格,要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、 原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等 都需采用。 试管常用 18mm×l80mm 或 20mm×200mm 规格。可用于培养较高的试管苗,另 外也不易污染。 培养器皿还可就地取材,采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的 200ml 罐头瓶,加盖半透明的塑料盖,由于瓶口大,所以大量繁殖时操作方便、工作效 率高,也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。 目前, 培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料 容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点,如培养容器多为平底方盒形, 可提高培 养空间利用率的植株数,并能一层层地叠摞起来,从而节约空间。这 类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成,能耐高温,可进行高压灭菌。有些产品为 一次性消耗品, 不但可节省洗涤人工,还可节省时间,提高效率。一次性塑料 容器或带螺丝帽的玻璃瓶,无须另外配盖,使用时比较方便。 瓶口封塞可用多种方法, 要具有一定的通气性和密闭性,以防止培养基干燥 和杂菌污染。以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染,且不易保持培 养基的湿 度。 现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,以线绳结扎或橡皮圈箍扎。 为了增加通气性,可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便,且通气好。 也可采用专用 的封口膜。 在组织培养中配制培养基, 贮藏母液,材料的消毒等需要各种化学实验用的 玻璃器皿,包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 烧杯;l0ml、l00ml、1000ml 量 筒;l00ml、1000ml 试剂瓶(棕色)等等。 (二) 、器械用具 1.镊子类(forceps) 常应用医疗上的镊子。 根据操作需要有各种类型,若用 l00ml 的三角瓶作为 培养瓶,可用 20cm 长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口,造成污染。镊子太 长,使用起来不灵活。如在分离茎尖幼叶时,则用钟表镊子。 2.剪刀类(scissors) 可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯 形剪刀,由于其头部弯曲,可以深入到瓶口中进行剪切。 3.解剖刀 切割较小材料和分离茎尖分生组织时,可用解剖刀。刀片要经常调换,使之 保持锋利状态,否则切割时会造成挤压,引起周围细胞组织大量死亡,影响培养 效果。 4.解剖针 解剖针可深入到培养瓶中, 转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼 叶,可以自制。 六、 培养条件

在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件,培养基组成、pH 值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。 (一) 、温度(temperature) 因为温度是植物组织培养中的重要因素,所以植物组织培养在最适宜的 温度下生长分化才能表现良好,大多数植物组织培养 都是在 23-27℃之间进行, 一般采用 25±2℃。低于 15℃时培养,植物组织会表现生长停止,高于 35℃时 对植物生长不利。但是,不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是 20℃、 月季是 25-27℃、番茄是 28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度,也 影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以 28℃为最好,在 12℃以下,33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同,百合鳞片在 30℃以下再的小鳞茎的 发叶速度和百分率都比在 25℃以下的高。 桃胚在 2-5℃条件进行一定时间的低温 处理,有利于提高胚培养成活率。用 35℃处理草莓的茎尖分生组织 3-5d,可得 到无病毒苗。 (二) 、光照(1ight) 组织培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时 间方面: 1、光照强度(1ight intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响,从目前的研究情况 看,光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说,光照强度较 强,幼苗生长的粗壮,而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2、光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导, 培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如 百合珠芽在红光下培养,8 周后,分化出愈伤组织。但在蓝光下培养,几周后才 出现愈伤组织,而唐菖蒲子球块接种 15d 后,在蓝光下培养首先出现芽,形成的 幼苗生长旺盛,而白光下幼苗纤细。 3、光周期(1igh period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养,最常用的周期是 16h 的光照,8h 的黑暗。研究表明,对短日照敏感的品种的器官组织,在短日照下 易分化,而在长日照下产生愈伤组织,有时需要暗培养,尤其是一些植物的愈伤 组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 (三) 、湿度(humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件, 容器内主要受培养基水分 含量和封口材料的影响。 前者又受琼脂含量的影响。 在冬季应适当减少琼脂用量, 否则, 将使培养基于硬,以致不利于外植体接触或插进培养基,导致生长发育 受阻。 封口材料直接影响容器内湿度情况,但封闭性较高的封口材料易引起透气 性受阻,也会 导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发,一般要求 70%-80%的相对湿 度, 常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水 分, 导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常 进行。湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染。

(四) 、渗透压(penetrating pressure) 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此,而影响到渗透压的变 化。通常 1-2 个大气压对植物生长有促进作用,2 个大气压以上就对植物生长有 阻碍作用,而 5-6 个大气压植物生长就会完全停止,6 个大气压植物细胞就不能 生存。 (五) 、pH 值 不同的植物对培养基最适 pH 值的要求也是不同的(表 2-1),大多在 5-6.5 左右,一般培养基皆要求 5.8,这基本能适应大多植物培养的需要。 表 2-1 不同植物的最适 PH 值 种 类 最适 PH 值 杜 鹃 4.0 月 季 5.8 越 桔 4.5 胡萝卜 、石刁 6.0 柏 蚕 豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.7 pH 值适度因材料而异,也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵 态氮作氮源就不一样,后者较高一些。一般来说当 pH 值高于 6.5 时,培养基全 变硬;低于 5 时,琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 pH 值(约 0.2-0.3 个 pH 值)因此在配制时常提高 pH 值 0.2-0.3 单位。pH 值大小调整可用 0.1M 的 NaOH 和 0.1M 的 HCI 来调整。lml 的 NaOH 可使 pH 值升高 0.2 单位,lml 的 HCI 可使 pH 值降低 0.2 单位。调节时一定要充分搅拌均匀。 (六) 、气体(gas) 氧气是组织培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通气问题,可用附有滤 气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥,夏季 易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。 ·培养室要 经常换气,改善室内的通气状况。液体振荡培养时,要考虑振荡的次数、振幅 等,同时要考虑容器的类型、培养基等。 复习思考题 (1)因地制宜建一个组织培养实验室,需要哪些分实验室?各分室的作用是 什么? (2)常规组织培养时,需要什么设备和器械?怎样使用? (3)组织培养中,pH 值起什么作用?如果 pH 值过高或过低会有什么后果? (4)如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度? 第二节 培养基及其配 制 目的要求: (1)一般掌握培养基的种类、特点; (2)掌握基本培养基的配方;

(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量; (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤; (5)熟练掌握培养基的灭菌方法; (6)一般掌握培养基的筛选办法。 培养基 culture medium 是 植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下, 不同种植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营 养的要求也不相同,只有满足了它们各 自的特殊要求,它们才能很好地生长。 因此,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,在建立一项新的 培养系统时,首先必须找到一合适的培养基,培 养才有可能成功。在植物组织 培养历史进程中,事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求 的不断认识,对已有培养基的改进,或者将新发现的植物 激素、新的有益成分 应用于培养基之中,都大大促进了组织培养研究的迅速发展,取得越来越多的 成功。 一、 培养基的种类和成分 (一)培养基的种类 培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用 不同的培养基。 培养基的产生最早是 Sacks(1680)和 Knop(1681),他们对绿色植物的成分 进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐 组成的 Sacks 和 Knop 溶液,至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。 以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基,White 培养基在 40 年代用得较 多,现在还常用。而到 60 和 70 年代则大多采用 MS 等高浓度培养基,可以保证 培养材料对营养的需要,并能生长快、分化快,且由于浓度高,在配制、消毒 过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡 培养基的名称, 一直根据沿用的习惯。 多数以发明人的名字来命名, 如 White 培养基,Murashige 和 Skoog 培养基(简称 MS 培养基),也有对某些成分进行改 良称作改良培养基, 目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下: (1)MS 培养基 它是 1962 年由 Murashige 和 Skoog 为培养烟草细胞而设计 的。特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比 例较合适,可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高, 广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。有些培养基 是由它演变而来的。 (2)B5 培养基 是 1968 年由 Gamborg 等为培养大豆根细胞而设计的。其主 要特点是含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知 有些植物在 B,培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。 (3)White 培养基 是 1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计的。 1963 年又 作了改良,称作 White 改良培养基,提高了 MgSO4:的浓度和增加了硼素。其特 点是无机盐数量较低,适于生根培养。 (4)N6 培养基 是 1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单,KNO3 和(NH4)2SO4 含量高。在国内已广泛应用于小麦、水 稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 (5)KM-8P 培养基 它是 1974 年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成 分较复杂,它包括了所有的单糖和维生素,广泛用于原生质融合的培养。

(二)培养基的成分 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持 材料等五大类。 1、水 水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命 活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养 基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质'大规模生产时可用自来水。但在少量 研究上尽量用蒸馏水,以防成分的变化引起不良效果。 2、无机元素(inorganicelement) 大量元素,指浓度大于 0.5mmol/L 的元素,有 N,P,K,Ca,Mg, S 等。其作用是: (1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分, 是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以 N03-N 和 NH4-N 两种形式供应。大多 数培养基既含有 NO,-N 又含 NH4-N。NH4-N 对植物生长较为有利。供应的物质有 KN03、NH4NO3 等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。 (2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷 也是 ATP、ADP 等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不 仅增加养分、 提供能量, 而且也促进对 N 的吸收, 增加蛋白质在植物体中的积累。 常用的物质有 KH2P04 或 NaH2PO4 等。 (3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K 增加时, 蛋白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易 过大,一般为 1-3mg/L 为好。制备培养基时,常以 KCl、KNO,等盐类提供。 (4)Mg、S 和 Ca、Mg 是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S 是含 S 氨 基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgSO4·7H2O 提供。用量为 1-3mg/L 较为适 宜;Ca 是构成细胞壁的一种成分,Ca 对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作 用,常以 CaCl2·2H2O 提供。 (5)微量元素 指小于 0.5mmol/L 的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co 等。铁 是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿 素形成的必要条件。 培养基中的铁对胚的形成、 芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时不用 Fe2(SO4)3 和 FeCl3(因其在 pH 值 5.2 以上,易形成 Fe(OH)3 的不溶性沉淀),而用 FeSO4·7H2O 和 Na2-EDTA 结合成螯合物使用。B,Mn,Zn, Cu,Mo,Co 等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生 长,发育异常现象。 总之,植物必需营养元素可组成结构物质,也可是具有生理活性的物质,如 酶、辅酶以及作为酶的活化剂,参与活跃的新陈代谢。此外,在维持离子浓度平 衡、胶体 稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不 足时, 愈伤组织表现出一定的缺素症状。 如缺氮, 会表现出一种花色素苷的颜色, 不能形成导 管;缺铁,细胞停止分裂;缺硫,表现出非常明显的褪绿;缺锰或 钼,则影响细胞的伸长。 3、有机化合物(organic compound) 培养基中若只含有大量元素与微量元素,常称为基本培养基。为不同的培养 目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几 类:

(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可 支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应 用。蔗糖使用浓度在 2%-3%,常用 3%,即配制 1L 培养基称取 30g 蔗糖,有时 可用 2.5%,但在胚培养时采用 4%-15% 的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起 重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看,以 葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一 些。不同植物不同组织的糖类 需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。高压灭菌时一 部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生 产时,可用食用的绵白 糖代替。 (2)维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参 与多种代谢活动,对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在 培养中都能合成所必需的维生素,但在数量上还明显不足,通常需加入一至数种 维生素,以便获得最良好的生长。主要有 Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、 Vpp( 烟酸) 、 VC(抗坏血酸 ) 、有时还使用生物素、叶酸、 VB2 等。一般用量为 0.1-1.0mg/L。有时用量较高。Vm 对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6 能促进根的生长, Vpp 与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc 有防止组织变褐的 作用。 (3)肌醇 (myo-inosit0l)又叫环己六醇,在糖类的相互转化中起重要作用。 通常可由磷酸葡萄糖转化而成,还可进一步生成果胶物质,用于构建细胞壁。肌 醇与 6 分子磷酸残基相结合形成植酸,植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁, 植酸可进一步形成磷脂,参与细胞膜的构建。使用浓度一般为 l00mg/L,适当 使用肌醇, 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。 对组织和细胞的繁殖、 分化有促进作用,对细胞壁的形成也有作用。 (4)氨基酸(aminoacide) 是很好的有机氮源,可直接被细胞吸收利用。培养 基中最常用的氨基酸是甘氨酸,其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白,它们是牛乳用 酶法等加工的水解产物,是含有约 20 种氨基酸的混合物,用量在 10-1000mg/L 之间。 由于它们营养丰富, 极易引起污染。 如在培养中无特别需要, 以不用为宜。 (5)天然复合物 其成分比较复杂,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合 物。 它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用,但对器官的分化作用不明 显。它的成分大多不清楚,所以一般应尽量避免使用。 1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。 一般使用浓度在 10%-20%,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织 和细胞培养中有促进作用。 在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的 促进作用,但茎尖组织的大小若超过 1mm 时,椰乳就不发生作用。 2)香蕉 用量为 150-200ml/l。用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色。 对 pH 值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用,对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后,加水煮 30min,再经过过滤,取其滤液 使用。用量为 150-200g/L。对 pH 值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4) 水 解 酪 蛋白 为 蛋白 质 的 水 解物 , 主 要成 分 为 氨 基酸 , 使 用浓 度 为 100-200mg/L。受酸和酶的作用易分解,使用时要注意。 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%),主要成分为氨基酸和维生素类; 麦芽提取液(0.01%-0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳 等,遇热较稳定,大多在培养困难时使用,有时有效。

4、植物激素(hormone) 是植物新陈代谢中产生的天然化合物, 它能以极微小的量影响到植物的细胞 分化、分裂、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和 休眠以及 萌发等许许多多的生理生化活动,在培养基的各成分中,植物激素是 培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。 (1)生长素类(auxin) 在组织培养中, 生长素主要被用于诱导愈伤组织形成, 诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对·生长素最敏 感。在极低的浓度下,(10.5-10.8mg/L)就可促进生长,其次是茎和芽。天然的 生长素热稳定性差, 高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶 的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。 IAA(indoaceticacid 吲哚乙酸)是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活 力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,高温高压易被破 坏,也易被细胞中的 IAA 分解酶降解,受光也易分解。 NAA(naphthaleneaceticacid 萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比 IAA 高 出 3-4 倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用 较普遍。NAA 和 IBA 广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(indolebutyric acid 吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)起动能力比 IAA 高 10 倍,特别在促进愈伤组织 的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适宜的用量范围 较狭窄,过量常有毒效应。 生长素配制时可先用少量 95%酒精助溶。2,4-D 可用 0.1mol/L 的 NaOH 或 KOH 助溶。生长素常配成 1mgdml 的溶液贮于冰箱中备用。 (2)GA(gibberellicacid 赤霉素) 有 20 多种,生理活性及作用的种类、部 位、 效应等各有不同、 培养基中添加的是 GA3, 主要用于促进幼苗茎的伸长生长, 促进不定胚发育成小植株;赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响, 当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化,比 值低时有利于韧皮部分化; 此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官 形成后,添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。 赤霉素溶于酒精,配制时可用少量 95%酒精助溶。赤霉素不耐热,高压灭 菌后将有 70%-100%失效,应当采用过滤灭菌法加入。 (3)细胞分裂素类(cytokinin) 这类激素是腺嘌呤的衍生物,包括 6-BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin 激动素)、n(zeatin 玉米素)等。其中 Zt 活性最强, 但非常昂贵,常用的是 6-BA。 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:①诱导芽的分化促进侧芽萌发生 长,细胞分裂素与生长素相互作用,当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时, 诱导愈伤组 织或器官分化出不定芽。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。 因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖,而避免在生根培养 时使用。 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织、是长根还是长 芽。如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中 生长素与细胞分裂素的比例。 生长调节物质的使用甚微, 一般用 mg/L 表示浓度。在组织培养中生长调节 物质的使用浓度,因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一般生 长素浓度的使用为 0.05-5mg/L,细胞分裂素 0.05-10mg/L。

5、培养材料的支持物 (1)琼脂(agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。 琼脂是一种由海藻中提 取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中,成为溶 胶,冷却至 40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的"煮化"培养基,就是使琼脂 溶解于 90℃以上的热水。琼脂的用量在 6-10g/L 之间,若浓度太高,培养基就 会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性不好。 新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的 为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外,还与高压灭菌时的 温度、时间、pH 值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加 之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失 凝固能力。 加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便, 通气问题易于 解决,便于经常观察研究等,但它也有不少缺点,如培养物与培养基的接触(即 吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物 排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂 几乎都含有杂质,特别是 Ca、Mg 及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞 的营养问题时, 则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成 的滤纸桥,然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。 (2)其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等,总的要求是排出的有害物质对培养 材料没有影响或影响较小。 6、抗生物质(antibiotic) 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在 5-20mg/L 之间。添加抗 生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常因污染 而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤 其对大量通气长期培养,效果更好。对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入 5%-10% 的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素 混用。 但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,可能某些植物适宜 用青霉素,而另 一些植物却不大适应。值得提醒的是,在工作中不能以为有了 抗菌素,而放松灭菌措施。此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升, 这可能是原来受抑制的 菌类又滋生起来造成的。 7、抗氧化物(antioxide) 植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或 由酶类催化氧化为相应的醌类, 产生可见的茶色、 褐色以致黑色, 这就是酚污染。 这些物 质渗出细胞外就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分化能力, 最终变褐死亡。在木本,尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。目前还没 有彻底完善 的办法,只能按不同的实际情况,加用一些药物,并适当降低培养 温度、及时转移到新鲜培养基上等办法,使之有不同程度的缓解,当然像严格选 择外植体部位、 加 大接种数量等也应一并考虑。 抗酚类氧化常用的药剂有半胱 氨酸及 Vc,可用 50-200mg/L 的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面,或过滤灭 菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、 及二乙基二硫氨基甲酸酯等。 8、活性炭(active carbon) 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构, 它结构疏松, 孔隙大, 吸水力强, 有很强的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小,吸附能力越大。

温度低吸附力强,温度高吸附力减弱,甚至解吸附。通常使用浓度为 0.5-108/ L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养 物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的 5-羟甲基糖醛及激素等。 茎尖初代培养,加入适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物;其效力 优于 Vc 和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长, 但其作用有一个阀值,一般为 0.1%-0.2%,不能超过 0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性碳减弱光照有 关,可能是由于根顶端产生促进根生长的 IAA,但 IAA 易受可见光的光氧化而破 坏,因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了 IAA,从而间接促进了根 的生长,由于根的生长加快,吸收能力增强,反过来又促进了茎、叶的生长。此 外,在培养基中加入 0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻 璃苗有良好作用。 活性炭在胚胎培养中也有一定作用,如在葡萄胚珠培养时向培养基加入 0.1%的活性炭,可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织。 但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附 100ng 左 右 的生长调节物质, 这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节 物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂。很细的 活 性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶。总之,那种随意 抓一撮活性碳放入培养基, 会带来不良的后果。 因此, 在使用时要有其量的意识, 使活性炭发挥其积极作用。 二、 培养基的制备 (一) 、母液(stocks01ution)的配制和保存 在植物组织培养工作中,配制培养基是日常必备的工作。为简便起见,通常 先配制一系列母液,即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液,这样不但可以保 证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,而且还便于低温保藏。一般母液配 成比所需浓度高 10-100 倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、 有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀,如 Ca2+和 S042-, Ca2+Mg2+和 PO43-一起溶解后,会产生沉淀,一定要充分溶解再放入母液中。配制 母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的 称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解,然后依次混合。一般 配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液,其中维生素 氨基酸类可以分 别配制, 也可以混在一起。 母液配好后放入冰箱内低温保存, 用时再按比例稀释。 下面以 MS 培养基制备为例,概述其制备方法。 (1)大量元素母液可配成浓度 10 倍母液。 用分析天平称取药品, 分别加 100ml 2+ 左右蒸馏水溶解后,再用磁力搅拌器搅拌,促进溶解。注意 Ca 和阳 PO43-易发生 沉淀。然后倒人 1000ml 定容瓶中,再加水定容至刻度,成为 10 倍母液。 (2)微量元素母液 可配成浓度配成比 100 倍的母液。 用分析天平按表准确称 取药品后,分别溶解,混合后加水定容至 1000ml。 (3)铁盐母液 可配成 100 倍的母液,按要求称取药品,可加热溶解,混合后 加水定容至 1000ml。 (4)有机物母液 可配成 500 倍的母液。按要求分别称取药品,溶解,混合后 加水定容至 500ml。 (5)激素母液的配制 每种激素必须单独配成母液,浓度一般配成 1mg/ml。用时根据需要取用。

因为激素用量较少,一次可配成 50ml 或 100ml。另外,多数激素难溶于水,要 先溶于可溶物质,然后才能加水定容。 它们的的配法如下: 将 IAA、IBA、GA 等先溶于少量的 95%的酒精中。再加水定容到一定浓度。 NAA 可先溶于热水或少量 95%的酒精中,再加水定容到一定浓度。2,4-D 可用 少量 1mol NaOH 溶解后,再加水定容到一定浓度。将 Kt 和 BA 先溶于少量 1mol 的 HCI 中再加水定容。将玉米素先溶于少量 95%的酒精中,再加热水到一定浓 度。配制好的母液瓶上应分别贴上标签,注明母液名称、配制倍数、日期及配 1L 培养基时应取的量。 (二) 、培养基的配制 按要求用量筒移取大量元素母液 100ml,用专一对应的移液管分别吸取微量 元素母液 10ml、铁盐母液 10ml、有机物母液 10ml,均置人 1000ml 定容瓶中, 若不加任何激素,则为 MS 培养基;若需加激素按配方移取激素母液即可。 将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到 1000ml,取 1/3 左右倒入小 铝锅中加热。同时,称好 30g 蔗糖,称琼脂丝 7g(或琼脂粉),也倾入小铝锅中, 边加热边搅拌,防止糊底。旺火煮开,再用文火加热,直至琼脂全部融化即清澈 见底为度。(若用琼脂粉,应加入 100ml 左右的液体培养基,并搅拌均匀)。然后 再倾入定容瓶余下的液体培养基,摇晃均匀即可。 培养基配好后, 要调整 pH 值。用 0.1M 的 NaOH 或 HCl 液调成 5.8pH 值左右。 在培养基配方不大变动的情况下可用经验法。 可以将连续三次测定所加入的酸或 碱液的平均值作为以后调整的用量值。调后注意一定要摇动均匀,还要注意酸或 碱液不要放置时间太久。 (三) 、培养基的分装与灭菌 培养基合成后要趁热分装,100ml 的容器约装入 30-40ml 培养基,即 1L 培 养基约装 35 瓶 左右。太多则浪费培养基,太少不易接种和影响生长。但要根据 培养对象来决定。 如果培养时间较长时, 应适当多装培养基, 生根等短期培养时, 可适当少加培养 基。分装时不要把培养基弄到管壁上,以免日后污染。装后用 封口材料包上瓶口,扎口后,写上培养基种类,准备灭菌。注意不能放置时间过 长,以免产生污染。 培养基用高压灭菌。打开锅盖,加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶, 连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内,装时不要过分倾斜培养基,以免弄到瓶口 上或流出。然后盖上锅盖,对角旋紧螺丝,接通电源加热,当升至 0.05MPa 时, 打开放气阀放气,回"0',后关闭放气阀。当气压上升到 0.10MPa 时,保压灭菌 20min, 到时停止加热。 当气压回"0"后打开锅盖, 取出培养基, 放于平台上冷凝。 灭好的培养基不要放置时间太长,最多不能超过 1 周。 复习思考题 (1)目前,常用的培养基种类有哪些?各有什么特点? (2)培养基包括哪些成分?各有什么作用? (3)简要说明 MS 培养基的基本组成? (4)配制培养基时,为什么要先配母液?如何配制母液? (5)怎样利用母液配制培养基? (6)培养基内加入活性炭的目的是什么?应注意什么问题? (7)配制培养基时,为什么要加入一定量的植物生长物质? (8)怎样进行培养基的高压湿热灭菌?

(9)试比较选择培养基时几种方法的优劣? 第三节 外植体的选择与培养 一、外植体的灭菌(sterilization) 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有 菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都 是有菌 的。依此观点,无菌室等未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养 基、 我们使用的刀、 剪在未处理之前、 我们身体的整个外表及与外界相连的内表, 如整个消化 道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都 是有菌的。 这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是: 极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强, 生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是: 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化 学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大气、 岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭 菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌世界要比 有菌世界小得多。 灭菌是指用物理或化学的方法, 杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物 体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消 除或充分 抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌 芽孢、 霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有 活着的微生物, 所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的 器皿, 以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的 操作,就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚至超过微生物的培养要 求,这是因为培养基含有丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭 菌的目的, 必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌,才能保证培养 时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和 灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清 洗和大量无菌水冲洗等措施; 化学方法是使用升汞、 甲醛、 过氧化氢、 高锰酸钾、 来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根 据工作中的不伺材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅 内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度 也随之增加。在 0.1MPa 的压力下,锅内温度达 121℃。在此蒸气温度下,可以 很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放 气有几种不同的做法, 但目的都是要排净空气, 使锅内均匀升温, 保证灭菌彻底。 常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到 0.05MPa 时,打开放气阀,放 出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。 关阀再通电后,压力表上升达到 0.1MPa 时,开始计时,维持压力 0 ,

1~0.15MPa,20min。 按容器大小不同,保压时间有所不同。如果容器体积较大,但是放置的数量 很少,也可以减少时间。到达保压时间后,即可切断电源,在压力降到 0.5MPa, 可缓慢放出蒸气,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容 器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待 冷 凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面。一旦放 置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外 压力平 衡,盖子便易开了。 对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭 菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培 养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。 对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压 塑料袋装好,高压灭菌 20-30min。 高压灭菌前后的培养基, 其 pH 值下降 0.2-0.3 单位。高压后培养基 pH 值的 变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高 pH 值至预定值的则相 反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大,甚至可大于 2 个 pH 值单位。环境 pH 值的变化大于 0.5 单 位就有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。 在 8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高 0.43 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使 15%-25%的蔗糖水解为 葡萄糖和果糖。培养基值小于 5.5,其水解量更多,培养基中添加 0.1%活性炭 时,高压下蔗糖水解大大增强,添加 1%活性炭,蔗糖水解率可达 5%。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法: (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,以便及时采取有效 措施。 (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避 免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以 IBA 代替 IAA,控制活性炭的用量(在 0.1% 以下)注意 pH 值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放 在最后加入。 (4)注意高压灭菌后培养基 pH 值的变化及回复动态。如高压灭菌后的 pH 值 常由 5.80 升高至 6.48。而 96h 后又回降至 5.8 左右。这样在实验中就可以根据 这一规律加以掌握。 2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中,使用之前取 出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用 250 或 500ml 的广口瓶,放人 95%的酒精,以便插入工具。 3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160-180~(2 的温度来杀死微生物。由于在干热 条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用 170~C 持续 90min 来 灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为 包扎, 以免灭菌后取用时重新污染。 包扎可用耐高温的塑料。 灭菌时应渐进升温, 达到预定温度后记录时 间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对

流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器 皿破裂。干热灭菌能源消耗太 大,浪费时间。 4、不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不 能用高压灭菌处理, 通常采用过滤灭菌方法。 防细菌滤膜的网孔的直径为 0.45um 以 下,当溶液通过滤膜后, 细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻, 在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。使用 前对其 高压灭菌, 将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射器, 推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。 5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌 (1)紫外线灭菌 在接种室、 超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌 是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细 菌的染色体变异,造成死亡。紫外线的波长为 200-300nm,其中以 260nm.的杀菌 能力最强, 但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面 的灭菌;而且要求距照射物以不超过 1.2m 为宜。 (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、 氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空 气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关 闭紧密即可。 化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或 降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来, 温度越 高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才 能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般 是浓度越大, 杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按 5-8m1/m3 用量,将甲醛置 于广口容器中,加 5g/m3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强 效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。 6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表 面等, 可用 70%的酒精反复涂擦灭菌,1%-2%的来苏儿溶液以及 0.25%-1%的 新洁尔灭也可以。 7、植物材料表面用消毒剂灭菌。 二、外植体的接种和培养 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源 一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌 处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫 做外植体(explant)。 首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用 适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自来水 龙头下流 水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细 小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入 洗衣粉清洗,然 后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表 面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物 质是表面活性物质-吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消

毒的烧杯、 玻璃棒、 70%酒精、 消毒液、 无菌水、 手表等。 用 70%酒精浸 10-30s。 由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之 70%酒精穿透力强,也很易 杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包 有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则 可只用 70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后 再剥除外层,取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。 表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取 1-2 种使 用见表 4-1 表 4-1 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 灭菌剂 使用 持续时间/min 去 除 的 难 效果 浓度 易 次 氯 酸 9%-10% 5-30 易 很好 钙 次 氯 酸 2% 5-30 易 很好 钠 氯化汞 0.1%,1% 5-8 较难 最好 抗菌素 30-60 中 较好 上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸 钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金 属汞离子来达到灭菌的; 过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残 留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗 3-4 次即可;由于用升汞液灭菌的材料,难 以对升汞残毒较难去除,所以应当用无菌水涮洗 8-10 次,每次不少于 3min,以 尽量去除残毒。 灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒 溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气 泡,使消毒彻底。在快到时间之前 1-2min, 开始把消毒液倾人一备好的大烧杯 内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。灭菌时间是从倒 入消毒液开始,至倒人无菌水时为止。记录时间还 便于比较消毒效果,以便改 正。灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容 器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80 或 Triton X 效果较好,这些表面活性剂主要作用 是使药剂更易于展布, 更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤 害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的 0.5%,即在 100ml 加入 15 滴。 最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次 3min 左右,视采用的消毒液种类, 涮洗 3-10 次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 (一) 、无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室内保 持定期用 1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前 用紫外线和甲醛灭菌外, 还可在使用期间用 70%的酒精或 3%的来苏儿喷雾,使 空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行: (1)在接种 4h 前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外灯进行灭菌;

(2)在接种前 20rain,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯; (3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿托鞋等; (4)上工作台后,用酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处。然后擦拭工作台面; (5)先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后 反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干; (6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; (7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌 30rain。若连续接种, 每 5 天要大强度灭菌一次。 (二) 、接种 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块, 放人培养基的过程。 以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌,现将接种前后的 程序连贯地介绍。 (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再 用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的 4 层纱布上或滤纸上。 (2)材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切 割。如叶片切成 0.5cm 见方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只 含 1-2 片幼叶的茎尖大小等。 在接种过程中要经常灼烧接种器械, 防止交叉污染。 (3)用 灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 具体操 作过程是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并 将管口在火焰上 方转动,使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口,可先在管口 外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送人试 管内,轻轻插入培养基 上。若是叶片直接附在培养基上,以放 1-3 块为宜。至 于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外,其他尚无统一要求。放置材 料数量现在倾向少放, 通过统计认为:对外植体每次接种以一支试管放一枚组块 为宜,这样可以节约培养基和大力,一旦培养物污染可以抛弃。接完种后,将管 口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过 火。 三、 培养和驯化 (一)培养 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里,使之生长,分裂和分化形 成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1、培养方法 (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该 方法设备简单,易行,但养分分布不均,生长速度不均衡,并常有褐化中毒现象 发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 由于液体中氧气含量较 少, 所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,采用往复式 摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一般为,50-100r/min,这种定期浸没的方 法,既能使培养基均一,又能保证氧气的供给。 2、培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后,最初的几

代培养。初代培养时,常用诱导或分化培养基,即培养基中含有较多的细胞分裂 素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括:茎梢、芽丛、胚状体和原 球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为: 1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素,可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长, 从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。 在几个月内可以将这种丛生 苗的一个枝条转接继代,重复芽-苗 增殖的培养,并且迅速获得多数的嫩茎。然 后将一部分嫩茎转移到生根培养基上, 就能得到可种植到土壤中去的完整的小植 株。一些木本植物和少数草本植物也可以 通过这种方式来进行再生繁殖,如月 季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插,它不经过发生愈 伤组织而再生,所以是最能使无性系后代保持原 品种特性的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物,在采样时,只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切 段,其他如种子萌发后取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。 它采用极其幼嫩的顶芽的茎 尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中,采用包括茎尖分生组织在内的 一些组织来培养,这样便保证了操作方便以及容易成活。 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长,有直立向上的茎梢,扩繁时主 要用切割茎段法,如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽, 形成芽丛。 2)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的 细胞。然后,经再分化,即由这些分生组织形成器官原基,它在构成器官的纵轴 上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数情况下它先形成芽,后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽, 有些植物具有从各个器官上长出不 定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下,培养基中提 供了营 养,特别是提供了连续不断植物激素的供应,使植物形成不定芽的能力 被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。'在许多 常规方法中不能无性繁殖的种类,在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再 生,如柏科,松科,银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不 定芽,用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时, 也常用诱导或分化培养基。 用靠培养不定芽得到的培养物, 一般采用芽丛进行繁殖,如非洲菊、草莓等。 3)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同,它也通过球形,心形,鱼雷形和 子叶形的胚胎发育时期,最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以 从愈伤组织表面产生, 也可从外植体表面已分化的细胞中产生,或从悬浮培养的 细胞中产生。 4)初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后, 其表面开始褐变,有时甚至会使整个培养基褐变 的现象。 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活,而使细胞的代谢发生 变化所 致。在褐变过程中,会产生醌类物质,它们多呈棕褐色,当扩散到培养 基后,就会抑制其他酶的活性,从而影响所接种外植体的培养。 5)外植体的褐变及其防止措施 褐变的主要原因如下:

①植物品种 研究表明,在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化 酶活性上的差异,因此,有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变,而有些花 卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此,在培养过程中应该有所选择,对不 同的品种分别进行处理。 ②生理状态 由于外植体的生理状态不同,所以在接种后褐变程度也有所不 同。一般来说,处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅,而从已经成年的植株采收 的外植体,由于含醌类 物质较多,因此褐变较为严重。一般来说,幼嫩的组织 在接种后褐变程度并不明显,而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 ③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加, 此外, 细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性, 从而使褐变现 象加深。 ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚 氧化酶的活性提高,从而加速被培养的外植体的褐变程度。 为了提高组织培养的成苗率,必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用 以下措施防止、减轻褐变现象的发生。 ①选择合适的外植体 一般来说,最好选择生长处于旺盛的外植体,这样可 以使褐变现象明显减轻。 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代 培养均可以减轻材料的褐变现象。 ③使用抗氧化剂 在培养基中,使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较 为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用 0.1%-0.5%的活性炭对 防止褐变也有较为明显的效果。 ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔 12-24h 的培养后, 再转移到新的培养 基上,这样经过连续处理 7-lOd 后,褐变现象便会得到控制或大为减轻。 (2)继代培养 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多, 它们需要进一步增殖,使之越来越多,从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 旨在繁殖出相当数 量的无根苗, 最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增 加的过程。如果以 2 株苗为基础,那么经 10 代将生成 210 株苗。 继代培养中扩繁的方法包括:切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球 茎等。 切割茎段常用于有伸长的茎梢、 茎节较明显的培养物。 这种方法简便易行, 能保持母种特性。 培养基常是 MSo 基本培养基;分离芽丛适于由愈伤组织生出的 芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块,放入 MS。 培养基中,待到稍大时,再分离开来继续培养。 增殖使用的培养摹对于一种植物来说每次几乎完全相同, 由于培养物在接近 最良好的环境条件,营养供应和激素调控下,排除了其他生物的竞争,所以能够 按几何级数增殖。 在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程, 而继代培养则是经常性不停的 进行过程。但在达到相当的数量之后,则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从 某种意义上讲,增殖只是贮备母株,而生根才是增殖材料的分流,生产出成品。 (3)继代培养时材料的玻璃化 实践表明,当植物材料不断地进行离体繁殖时,有些培养物的嫩茎、叶片往 往会呈半透明水迹状, 这种现象通常称为玻璃化。 它的出现会使试管苗生长缓慢、

繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根,因此,使繁殖系数大为降低。在不同 的种类、品种间,试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平 较高时, 也容易出现玻璃化现象。 在培养基中添加少量聚乙烯醇、 脱落酸等物质, 能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。 呈现玻璃化的试管苗,其茎、叶表面无蜡质,体内的极性化合物水平较高, 细胞持水力差,植株蒸腾作用强,无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养 容器中空气湿度过高,透气性较差造成的,其具体解决的方法为: ①增加培养基中的溶质水平,以降低培养基的水势; ②减少培养基中含氮化合物的用量; ③增加光照; ④增加容器通风,最好进行 C02 施肥,这对减轻试管苗玻璃化的现 象有明显的作用; ⑤降低培养温度,进行变温培养,有助于减轻试管苗玻璃化的现象 发生; ⑥降低培养基中细胞分裂素含量,可以考虑加入适量脱落酸。 3、生根培养 当材料增殖到一定数量后, 就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能 及时将培养物转到生根培养基上去,就会使久不转移的苗子发黄老化,或因过分 拥挤而使 无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程,这个过程 目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用 1/2 或者 1/4MS 培养基, 全部去掉细胞分裂素,并加入适量的生长素(NAA、IBA 等)。 诱导生根可以采用下列方法①将新梢基部浸入 50 或 100ml6-BA 溶液中处理 4-8h;②在含有生长素的培养基中培养 4-6d;③直接移入含有生长素的生根培 养基中。 上述三种方法均能诱导新梢生根,但前二种方法对新生根的生长发育则 更为有利。 而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高 浓度生长素的继续存在,则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。 另外也可采用下列方法就可生根。①延长在增殖培养基中的培养时间;②有 意降低一些增殖倍率, 减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步);③ 切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根,此方法则没有生根阶段。可以省去一次培 养基制作, 切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理,但这种方法只适于一些容易 生根的作物。 另外少数植物生根比较困难时,则需要在培养基中放置滤纸桥,使其略高于 液面,靠滤纸的吸水性供应水和营养,从而诱发生根。 从胚状体发育成的小苗, 常常有原先已分化的根,这种根可以不经诱导生根 阶段而生长。但因经胚状体途径发育的苗数特别多,并且个体较小,所以也常需 要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段,以便壮苗生根。 试管内生根壮苗的阶段, 为了成功地将苗移植到试管外的环境中,以使试管 苗适应外界的环境条件。 通常不同植物的适宜驯化温度不同。 如菊花, 以 18-20℃ 为宜。 实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类 易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓,或不易成活。春季低温时苗床可加设 电热线,使基质温度略高于气温 2-3t,这不但有利于生根和促进根系发达,而 且还有利于提前成活。 移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高, 并可适应强度较高

的漫射光,(约 4000lx 左右),以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激 蒸腾加强,会使水分平衡的矛盾更尖锐。 第四节、 试管苗的驯化与移栽 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节,这个工作环节做不好,就会造成前 功尽弃。为了做好试管苗的移栽,应该选择合适的基质,并配合以相应的管理措 施,才能确保整个组织培养工作的顺利完成。 试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近 100% 的相对湿度 环境条件下生长的,因此,在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有 着很大的差异。所以必须通过炼苗,例如通过控水、减肥、增光、降温等 措施, 使它们逐渐地适应外界环境,从而使生理、形态、组织上发生相应的变化,使之 更适合于自然环境,只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。 从叶片上看,试管苗的角质层不发达,叶片通常没有表皮毛,或仅有较少表 皮毛,甚至叶片上出现了大量的水孔,而且,气孔的数量、大小也往往超过普通 苗。由此 可知,试管苗更适合于高湿的环境生长,当将它们移栽到试管外环境 时,试管苗失水率会很高,非常容易死亡。因此,为了改善试管苗的上述不良生 理、形态特点, 则必须经过与外界相适应的驯化处理,通常采取的措施有:对 外界要增加湿度、减弱光照;对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降 低空气湿度等。 另外, 对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长,对外 界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率,在培养基质中可掺人 75% 的百菌清可湿性粉剂 200-500 倍液,以进行灭菌处理。 一、移栽用基质和容器 适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力,容易灭菌处 理,并不利于杂菌滋生的特点,一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘 着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配,一般用珍珠岩, 蛭石,草炭土或腐殖土比例为 1:1:0.5。也可用砂子:草炭土或腐殖土为 1:1。 这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少 3h 烘烤来消灭其中的微生物。要根据 不同植物的栽培习性来进行配制,这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种 常见的试管苗栽培基质。 1、河砂 河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂,其颗粒直径为 1-2mm。细砂即通常所说的面砂,其颗粒直径为 0.1-0.2mm。河砂的特点是排水 性强,但保水蓄肥能力较差,一般不单独用来直接栽种试管苗。 2、草炭土 草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成,其保水性 好,蓄肥能力强,呈中性或微酸性反应,但通常不能单独用来栽种试管苗,宜与 河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。 3、腐殖土 腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成,一种是人为造成,人 工制造时可将秋季的落叶收集起来,然后埋人坑中,灌水压实令其腐烂。第二年 春季将其 取出置于空气中,在经常喷水保湿的条件下使其风化,然后过筛即可 获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质,它通常不能单独使用。掺有腐殖 土的栽培基质有 助于植株发根。

4、容器 栽培容器可用 6× 6cm-10×l0cm 的软塑料钵,也可用育苗盘。前者占地大, 耗用大量基质,但幼苗不用再移,后者需要二次移苗,但省空间、省基质。 二、移栽前的练苗 移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼 2-3d,让试管苗接受强光的 照射,使其长得壮实起来,然后再开口练苗 1-2d,经受较低湿度的处理,以适 应将来自然湿度的条件。 三、移栽和幼苗的管理 从试管中取出发根的小苗,用自来水洗掉根部粘着的培养基,要全部除去, 以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去,应避免造成伤根。栽植时用一个筷子 粗的竹签 在基质中插一小孔,然后将小苗插入,注意幼苗较嫩,防止弄伤,栽 后把苗周围基质压实,栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移人高湿度的 环境中。保证空 气湿度达 90%以上。 1、保持小苗的水分供需平衡。在移栽后 5-7d 内,应给予较高的空气湿度条 件,使叶面的水分蒸发减少,尽量接近培养瓶的条件,让小苗始终保持挺拔的状 态。 保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水,所放置的床面也要 浇湿,然后搭设小拱棚,以减少水分的蒸发,并且初期要常喷雾处理,保持拱棚 薄膜上有水珠出现。当 5-7d 后,发现小苗有生长趋势,可逐渐降低湿度,减少 喷水次数,将拱棚两端打开通风,使小苗适应湿度较小的条件。约 15d 以后揭去 拱棚的薄膜,并给予水分控制,逐渐减少浇水,促进小苗长得粗壮。 2、防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的,移出来以后难以保持 完全无菌,因此,应尽量不使菌类大量滋生,以利成活。所以应对基质进行高压 灭菌或烘烤灭菌。 可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗,如多菌 灵、托布津,浓度 800-1000 倍,喷药宜 7-l0d 一次。在移苗时尽量少伤苗,伤 口过多,根损伤过多,都是造成死苗的原因。喷水时可加入 0.1%的尿素,或用 1/2MS 大量元素的水溶液作追肥,可加快苗的生长与成活。 3、一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件,适宜的生 根温度是 18-20℃,冬春季地温较低时,可用电热线来加温。温度过低会使幼苗 生长迟缓,或不易成活。温度过高会使水分蒸发,从而使水分平衡受到破坏,并 会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照,如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸 等,以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时,逐渐加强 光照,后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累,增强抗性,促其成活。 4、保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质,保证良好的通气作 用。在管理过程中不要浇水过多,过多的水应迅速沥除,以利根系呼吸。 综上所述,试管苗在移栽的过程中,只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂 菌和适宜的光、温条件控制好,试管苗是很容易移栽的。 四、试管苗增殖率的估算 由于试管苗在接近理想的条件下生长分化,已不受季节的限制,并且有人为 提供的外源植物激素的促进, 增殖的速度是很快的。在生长分化中经过几个周期 的培养通 常按接种的繁殖体块数,或按培养瓶计算,看看能得到多少块中间繁 殖体,或得到了多少瓶繁殖体,这两种方法都比较准确。但不能简单地按接种 1 个芽, 培养后能数出多少个芽来, 或按应能再切出多少块供再接种的材料来计算。 有了每一周期(从接种当天到再次可供接种的当天)需要多少天, 每一周期每一瓶

能接种多少瓶,(每周期都能稳定地达到)每瓶有多少苗,这几个基本数字,就可 以根据几何增加的原理,按下面简单的公式计算出年增殖率的理论值: 年增殖率:y;每周期增殖的倍数:x;全年可增殖的周期数:n:365/ 每一周期的天数; y=xn 如果现有 5 个繁殖块,每个月为一个繁殖周期,那么年增殖率为 512。 从这一公式可以看出,培养周期愈短、每次增殖的倍数愈高,年增殖总倍数 就更高。只要每年能增殖 8-10 次,每次增殖 3-4 倍以上,就可以满足快速繁殖 的要求。 如果从 100 瓶开始,每瓶有 10 株苗,那么即使每次增殖 3 倍,每次 45d, 一年可增殖 8 次,年底即可达 56 万瓶,即 560 万 株苗,许多植物都远远超过这 一数值。当然这是一理论值,它会受到许多因素的制约。例如污染就是其中主要 因素之一,另外还有设备和人力的规模与容量的限制, 比如培养用的瓶子就不 可能成几何级数地增加。接种、做培养基的工人也不可能如此增加,因此,这个 理论数字是难以做到的。但在条件、规模具备的情况下,还是 有可能做到的, 如某试管苗工厂,年生产并种植成活 310 万株苗,最多时工人没有超过 20 人。 平均每人每年做出十几万株苗。在设备比较好的条件下, 2 名工人每天生产 300-500 株苗还是能应付自如的,则 1 年生产出 8-10 万株苗是完全可能的。 第五节 快速 繁殖工作的计划安排 快速繁殖是一项复杂的系统工程,快速繁殖工作应力求做到周密细致。在具 体实施中首先要限制增殖的瓶数。存架增殖总瓶数(T)不 应过多或过少,如盲目 增殖,一段时间后就会因缺乏人力或设备,处理不了后续的工作,使增殖材料积 压,一部分苗子老化,超过最佳接转继代的时期,造成生根不 良、生长势减弱、 增殖倍率降低等等不良后果。 增殖瓶数不足, 也会造成母株数不够用, 延误产苗。 因此,只要适当增加比例,1 个周期不到就能纠正过来。存架增殖总瓶数=增殖 周期内工作日数 W×每工作日需用的母株瓶数 S。 举例来说,在矮牵牛扩繁中每天有 4 人接种,每人每天按接种 300 瓶计算, 则每个工作日需要 1200 瓶, 按一个月为一个增殖周期, 按每个月有 25 个工作日, 则存架增殖总瓶数为:25× 1200=30,000 瓶。 其次是考虑到每天接种增殖与生根的比例,需按实际情况试做后确定,一般 为 3:7,通过培养基中植物激素的用量、糖浓度、培养温度等条件也可加以调 整。 增殖倍率高的, 生根的比例大, 每个工作日需用的母株瓶数较少, 产苗数(即 生根的瓶数 X 每瓶植株数)较多。反之,增殖倍率低。另外因需要维持原增殖瓶 数,而占用了不少材料,以致不可能有较多的材料用于生根,因此出苗数就少。 由此可见调整最佳培养基,提高增殖倍率是很重要的研究项目。 从实际操作的角度讲每天接种生根的株数便是今后每天出瓶的苗数。 全年出瓶苗数(户)二全年总工作日×平均每个工作日出瓶小植株数×(1-损 耗率 10%) 全年产苗数×移栽成活率=实际年产苗数 按公式计算的数字控制增殖总瓶数, 可以使处于增殖阶段的苗子在两个周期 内全部更新一次培养基, 使苗子全部都处于不同生长阶段的最佳状态。下面用一 个实际例子计算一下就会更清楚了。

某实验室培养多种植物, 平均 35d 为一个增殖周期,按要求必须在 42d 全部 更新一次培养基。那么根据其所掌握的处理继代操作的能力,在 35-42d 内能处 理多少瓶, 架子上增殖的瓶数就不应超过这一数字。假定你自己专门从事做接种 工作。平均每天取用 30 瓶母种,转接成 100 瓶,其中 30 瓶为增殖用,以维持母 株的瓶数,另外 70 瓶用于生根。在 35-42d 内有 30-36 个工作日,那么 存架增 殖总瓶数是多少,具体计算如下: 存架增殖,总瓶数 T:30× 30 或 30× 36 即:T=900 或 1080(瓶) 增殖与生根比例为 3: 7, 每天出瓶 700 苗(70 瓶), 全年出瓶苗数(户)=300(工 作日) × 700×(1-损耗率 10%)二 210,000(株) ×90%=189,000(株) 全年实产成活幼苗数:189000× 85%(移栽成活率)=160,650(株) 如果生根需 2-3 周,那么生根阶段的瓶子存架数也可计算出 (2-3 周内有 12-19 个工作日):12× 70 或 19× 70,则约 840-1330 瓶 由于在 1 个人全力接种的条件下,需培养架 4 个左右。因此提高利用率的最 好办法是加强周转。 再如人们可以在有限的工作时间和工作条件下,抓紧制作培养基和高压灭 菌,然后利用比较集中完整的一段时间,摆上自制的无菌接种箱做接种操作。这 样可在 40d 的周期内总共可做 6 次接种,每次处理增殖好的材料为 10 瓶,接种 到 35 瓶,其中 10 瓶仍维持增殖,余下的 25 瓶使幼苗生根,那么上述几项数字 计算如下: 存架增殖总瓶数厂:10×6 二 60(瓶) 增殖与生根的比例为:10:25 即 1:2.5 每次 25 瓶,40d 内接种 6 次,6×25:150(瓶) 全年出瓶苗数:40d 一个周期,全年做 9 个大周期(365/40:9.1),每 40d 中接种 6 次 150 瓶, 全年可得: 9×150: 1350(瓶), 若每瓶 10 株, 全年可得 13500 株。扣除污染和生根不良的弱苗约 10%,应可有 12150 株。 全年实产成活苗数为:12150× 85%(成活率):10328(株)。 存架生根苗总瓶数,如果苗子能在 3 周内生根,需占用 75 瓶,在 4 周内生 根则要占用 100 瓶。 从上面的例子可以说明, 快速繁殖的速度确是很可观的,快速繁殖是由较高 的增殖倍数,较短的增殖周期和周年生产这三个因素组成的,因此,凡是应用于 生产的种 类都必需满足这三个因素。尤其是第一、二个因素,如果达不到要求, 那将还是处于研究、 开发阶段的种类。 还要考虑整套技术, 比如无菌操作不熟练, 污染比例太 高,出了苗栽不活等等。 在总体设计上要计划安排出,幼苗出瓶种植的工作量,知道一个生产体系效 率的高不高,接种工序则影响最大,而且是试管繁殖中最核心的技术。况且目前 世界各地都还处于手工操作阶段,短期内不太容易实现自动化。在操作中每个操 作工 1d 最大工作量使用 200 个培养容器,每个容器接种 10 株。目前已有许多研 究者着手开发实现接种操作的自动化(机器人接种),可见需求之迫切。 植物的快速繁殖也应实行有效的管理办法,以迅速提高其生产效率。比如, 按植物类型不同,无菌操作复杂程度不同,分别制定出工作的质量与数量标准, 对从事操 作的人员给予短期严格训练,挑选优秀的人员固定在岗位上,同时给 予有吸引力的报酬。接种环节加速了,其他环节的运转也自然会被带动起来。 本章小结 (1)常用的培养基有:①MS 培养基,其特点是无机盐和离子浓度较高;②B5

培养基,其特点是含有较低的铵;③White 培养基,其特点是无机盐低,适于生 根;④N6 培养基,其特点是 KNO3 和(NH4)2SO4 含量较高,适于花药培养;⑤KM-8P 培养基,其特点是有机成分较多,适于原生质体培养。 (2)水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要 成分。 (3)配制培养基时,为便于保存,提高效率,通常先配制母液。即先配成大 量元素 10 倍液;微量元素 100 倍液;铁盐 100 倍液;有机物 500 倍液;激素 1mg /l 倍液。 (4)培养基常分装到 160ml 的三角瓶,含量一般为每瓶 30-40ml;高压灭菌 时,压力通常为 0.1MPa 以上,持续 20min。 (5)筛选合适的培养基一般有四种方法,即单因子试验法、多因子试验法、 逐步添加和排除法以及广谱实验法。其中,第一种方法比较简单,第二种方法比 较准确,而后两种方法则比较复杂。 (6)植物组织培养技术包括灭菌、接种、培养和驯化四个环节。 (7) 灭菌是指用物理或化学的方法杀死物体表面和孔隙内的微生物及其孢 子。消毒是指杀死、消除或抑制部分微生物的活动,使之不能再发生危害作用, 不如灭菌彻底。 (8)常用的灭菌方法有两种:物理方法和化学方法。干热、湿热、射线处理、 过滤等属于前者;升汞、来苏水、高锰酸钾、酒精等化学药剂处理则属于后者。 (9)培养基一般采用湿热灭菌法;耐热的玻璃器皿和器械一般采用干热灭菌 法; 镊子等接种用工具则采用灼烧灭菌法;不耐热的物质如生长调节剂等一般采 用过滤除菌法。 (10)高压蒸气灭菌前,要注意排净里面的冷空气;保压时间到达后,要使指 针回零才能开盖取物。 (11)接种程序包括①植物材料表面的消毒;②切割外植体;③将外植体移人 培养基。 (12)培养方法主要有固体培养法和液体培养法。前者是比较常用的方法,简 便易行。 (13)接种后材料的培养步骤可分为: ①初代培养; ②继代培养; ③生根培养。 (14)驯化时要注意培养基质的选择和温、光、水、肥、气的综合管理。 (15)在快速繁殖计划安排上,要注意增殖倍数与现有的人力、物力相协调, 以提高生产效率。 复习思考题 (1)灭菌和消毒有何差别?为什么? (2)常用的灭菌方法各有哪些优缺点? (3)采用高压蒸汽锅高压灭菌时,应注意哪些事项? (4)实验人员进入接种室接种之前,应做哪些准备工作? (5)接种的植物材料如何进行预处理?如何接种? (6)根据发育方向,初代培养可分为几种类型? (7)组织培养中,怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗? (8)试管苗驯化中应注意调节什么因素? (9)如何估测增殖率?如何安排快速繁殖计划? 第3章 愈伤组织培养

教学目的: 1、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点 2、掌握植物激素控制理论? 3、掌握愈伤组织的形态发生 4、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株 5、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用 愈伤组织培养(callus culture)是指将母体植株上的各个部分切下,形成外 植体,接种到无菌的培养基上,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。一 般情况下、植物组织均能诱发形成愈伤组织;由外植体形成愈伤组织,标志着植 物组织培养的开始。 第一节 一、愈伤组织的诱导 细胞是植物结构和生命活动的基本单位, 能够分裂、 繁殖和分化出不同形态、 执行不同功能的组织和器官。 细胞具有全能性, 每个细胞都具有全套的遗传信息, 在特定环境下能进行表达, 产生一个独立完整的个体。愈伤组织的诱导就是使已 分化的植物细胞脱离原来的发育轨道,失去原有状态和功能,恢复到未分化的状 态的过程。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物组织容易形成愈伤组织。幼 年组织细胞比成年组织容易,二倍体比单倍体容易。 外植体可选用植物茎、根、叶、花、种子的切段,培养过程中植物生长调节 剂是重要的成分。一般要在培养基中添加 2,4-D、NAA、IAA、IBA、BA 等。有些 天然物也对愈伤的诱导和维持十分有益如椰子汁、酵母提取物、蕃茄汁等。 二、愈伤组织细胞的分化 植物细胞形成愈伤组织大致经历三个时期:诱导期、分裂期、分化期。即脱 分化恢复分裂,持续分裂增生和进一步再分化形成植株。 (一)诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期。其主要目的是通过一些刺激因素和激素 的诱导使原本处于静止期的细胞合成代谢活化,进而发生分裂。 2,4-D 对于细胞中 RNA 的转录合成有明显的促进作用,常被用于愈伤组织的 诱导。诱导期中细胞生理指标的变化有:1.氧气吸收的迅速增加,2.RNA 含量的 增加,3.蛋白质的周期性增加,4.代谢相关酶类的增加。 (二)分裂期 愈伤组织的诱导与分化

分裂期是指细胞通过分裂不断增生子细胞的过程。 主要表现如下: 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养 7 天后,细胞数可增加 10 倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快 的缘故。 3.细胞体积小,内无液泡,如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 4.细胞的核和核仁增大到最大。 5.细胞中 RNA 含量减少,而 DNA 含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和生长,细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加, 新细胞壁的合成极快。 分裂期的愈伤组织的共同特征是:细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织的结 构,维持其不分化的状态,颜色浅而透明。 来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织,在颜色、结构和生长习 性上都可能存在差异。但优良的愈伤组织必备以下 4 个特性中的 2-3 个。 1、高度的胚性或再分化能力,以便从这些愈伤组织得到再生植物。 2、容易散碎,以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系,并且在需要时能从 中分离出全能性的原生质体。 3、旺盛的自我增殖能力,以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性 系。 4、经过长期继代保存而不丧失胚性,便有可能对它们进行各种遗传操作。 (三)分化期 分化期是指愈伤组织细胞停止分裂,细胞内发生一系列形态和生理上的变化, 形成一些不同形态和功能的细胞的时期。其分化期特点如下: 1.细胞分裂部位和方向发生改变:由原来局限在组织外缘的平周分裂转为 组织内部较深层局部细胞的分裂。 2.形成瘤状或片状的拟分生组织,称做分生组织结节。分生组织结节可以 成为愈伤组织的生长中心,或者进一步分化为维管组织结节。 3.细胞的体积相对稳定,不再减少。 4.出现了各种类型的细胞:如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色 素细胞等。 5.生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色,老化的多转化为黄色或 褐色。 第二节 愈伤组织的继代培养

培养物在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭,水分散失,以及 代谢产物的积累,必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 一般在 25~28℃下 进行固体培养时,每隔 4~5 周进行一次继代培养。通过继代培养,可使愈伤组 织无限期地保持在不分化的增殖状态。 一、培养基和培养条件 (一)培养基 常用 MS、N6 培养基 1.无机营养 培养基中的 N,大多数都用硝态氮,MS 和 B5 培养基中既有硝态 N、也有铵态 N 对细胞分化起重要作用。当某些营养元素供应不足时,愈伤组织表现的症状如 下: 氮——某些组织(如五叶地锦)表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色; 不能形成导管。 氮、钾和磷——细胞过度生长,形成层组织减退; 硫——非常明显地褪绿。 铁——细胞分裂停止。 硼——细胞分裂停滞,细胞伸长。 锰或钼——影响细胞伸长。 2.植物生长物质: 植物生长物质的使用甚微,一般使用的浓度为 0.1~10mg/L。 使用植物生长调节剂时,要注意种类和浓度,特别是生长素和细胞分裂素的 比值。 3.有机成分 培养基中加入糖、各类 B 族维生素、肌醇和甘氨酸等,可以满足愈伤组织的 生长和分化的要求。各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质,可以促进器官分化。水解 酪蛋白中含有多种氨基酸, 有助于器官分化。 酰胺类往往有促进器官形成的作用。 (二)培养条件 培养方式分为固体和液体培养两大类。液体培养又分静止和振荡培养的二 类。 1.光照 在愈伤组织诱导阶段,一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三种方式。 愈伤组织的诱导需弱光或不需光。继代培养一般需光。器官发生阶段,一般周期 性光照比较好。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 2、温度

多数植物在 24~28℃的恒温培养,可较好地形成芽和根。国内有关小麦、水 稻花药培养温度试验的报道认为:在诱导花形成愈伤组织时,昼夜恒温较好,而 在器官分化时,昼夜具有一定温差比较好,分化出的小植株比较健壮。 二、继代培养物的分化潜力 影响继代培养的分化能力,主要有以下两个因素 1、生理因素 在组织培养过程中,由于植物材料内部的一些变化,而导致继代培养物分化 潜力发生变化。 2、遗传因素 在继代培养中通常出现染色体紊乱。 三、继代培养物的体细胞变异 第三节 愈伤组织的形态发生

形态建成:外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化,产生芽和 根,或者形成胚状体,发育成苗或完整植株。 一、不定芽和根的发生 指细胞或愈伤组织,通过形成不定芽再生成植株。这是组织培养中常见的器 官发生方式。 生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件,决定着发育的方向: 是愈伤组织、长根还是长芽。生长素/细胞分裂素比例决定分化的方向:高则利 于根的形成,适中利于愈伤组织的形成;低则利于芽的形成 器官发生形成小苗有如下四种方式: (1)愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成,即无根的芽或无芽的根; (2)先形成芽,后在其茎的基部长根,多数情况; (3)先长根,再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成,尤其对于 单子叶植物; (4)先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根,然后两者结合起来形 成一株小植株。少见。 二、体细胞胚的发生 指在组织培养中,由一个非合子细胞(体细胞),经过胚胎发生和胚胎发育过 程(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚 5 个时期),形成的具有双极 性的胚状结构。 胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:

①最根本的特征是具有两极性,即在发育的早期阶段,从其方向相反的两端 分化出茎端和根端;而不定芽和不定根都为单向极性。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系,而不定芽或 不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。 ③胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”字形,而不定芽的维管组织无此 现象。 胚状体方式比不定芽方式有更多的优点: 胚状体产生的数量比不定芽多; 胚状体可以制成人工种子, 便于运输和保存; 胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。 第四节 愈伤组织培养的应用

在园艺植物育种中具有广阔的前景: 1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度; 2、培育无病毒苗木; 3、获得倍性不同的植株; 4、克服远缘杂交困难; 5、利于种质资源长期保存和远距离运输; 6、提供育种中间材料; 7、诱发和离体筛选突变体; 8、制造人工种子。

本章小结: 1、愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下,形成外植体,接种到 无菌的培养基上,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 2、植物细胞形成愈伤组织大致经历三个时期:诱导期、分裂期、分化期。 3、诱导期、分裂期、分化期细胞的特点 4、分裂期的愈伤组织的共同特征是:细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织 的结构,维持其不分化的状态,颜色浅而透明。 5、继代培养是培养物在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭, 水分散失,以及代谢产物的积累,必须转移到新鲜培养基上培养。 6、培养方式分为固体和液体培养两大类。液体培养又分静止和振荡培养的 二类。 7、形态建成:外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化,产生 芽和根,或者形成胚状体,发育成苗或完整植株。

8、器官发生形成小苗有如下四种方式: (1)愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成,即无根的芽或无芽的根; (2)先形成芽,后在其茎的基部长根,多数情况; (3)先长根,再从根的基部长芽。 (4)先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根,然后两者结合形成一 株小植株。 9、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别: ①最根本的特征是具有两极性。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。 ③胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”字形,而不定芽的维管组织无此 现象。

第四章 器官培养 目的要求: (1)一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择; (2)掌握茎尖培养的种类和操作步骤; (3)掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整; (4)掌握离体叶片的培养步骤; (5)一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。 器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体 进行离体培养,是植物组织培养中最主要的一个方面,进行的植物种类最多,应 用的范围也 最广。器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织 分化和形态建成的最好材料和方法,而且在生产实践上具有重要的应用价值,如 利用茎、叶和花器 培养建立的试管苗,可在短期内提高繁殖速率,进行名贵品 种的快速繁殖;利用茎尖培养可得到脱毒试管苗,解决品种的退化问题,提高产 量和质量;将植物器官作 诱变处理,用器官培养可得到突变株,进行细胞突变 育种。 第一节 根的培养 离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系,因为根系生 长快,代谢强,变异小,加上无菌,不受微生物的干扰,并能根据研究需要,改 变培养的成 分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。另一方面,由根细胞可 再生成植株,不仅证明根细胞的全能性,而且也能产生无性繁殖系,用于生产实 践。其培养方法如下: 1、培养基 多为无机离子浓度低的 White 培养基,其他培养基如 MS,B,等 也可采用,但必须将其浓度稀释到 2/3 或 1/2。 2、根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒,在无菌条件下萌发,待根 伸长后从根尖一端切取长 1.2cm 的根尖,接种于培养基中。这些根的培养物生长

甚快,几天后发育出侧根。待侧根生长约 1 周后,即切取侧根的根尖进行扩大培 养,它们又迅速生长并长出侧根,又可切下进行培养,如此反复,就可得到从单 个根尖衍生而来的离体根的无性系。 这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面 的实验研究。培养条件为暗光和 25-27℃。 3、植株再生培养 根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成 愈伤组织。 第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、 在愈伤组织上分化成小植株。 第二节 茎尖的培养 一、茎尖培养 茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分,进行无菌培养。这 是组织培养中用得最多的一个取材部位。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分 为微茎尖培养和普通茎尖培养。 微茎尖指带有 1-2 个叶原基的生长锥,其长度不 超过 0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖(如几 mm 到几十 mm)、芽尖及侧芽。这里主 要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单,操作方便,茎尖容易成活,成苗所需时 间短。茎尖培养步骤如下: 1、取材 挑选杂菌污染少,生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷 几次灭菌药剂。 以保证材料不带或少带菌。 用于普通茎尖培养, 可先从植物的茎、 藤或匍匐枝上切取 2cra 以上的顶梢。 2、消毒接种 将采集到的茎尖切成 0.5-1.0cm 长,并将其大叶除去,休眠芽 预先剥除鳞片。 将茎尖置于流水冲洗 2-4h,再在 95%的酒精中处理 30s,然后 在稀释 20 倍的次氯酸钠中浸 5-8min,最后用无菌水冲洗数次,准备接种。 3、接种 为了减少污染,可在接种前再剥掉一些叶片,使茎尖为 0.5cm 左右 大小。 这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。有些植物的茎尖由于多酚氧化酶的氧 化作用而变褐。所以在接种时,不能用生锈的解剖刀,动作要敏捷,随切随接, 减少伤口在空气中暴露的时间, 也可配制 1%-5%Vc 液,将切下的茎尖材料浸入 处理一下。 4、培养的方法和程序 (1)培养基 多数茎尖培养采用 MS 作为基本培养基或略加修改, 或补加其他物 质。常用的其他培养基有 White,Heller,等。培养基中生长素是必须的,如 2, 4-D,IAA, NAA 等,它们能有效地促进芽的生长发育,但是浓度不能太高,一 般用 0.1mg/L 左右,高于此浓度,往往产生畸变芽或形成愈伤组织。但要注意 不同植物对生长素的反应是不同的。 茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。生长 太慢即接种后茎尖不增大,只是茎尖逐渐变绿,出现绿色小点,细胞逐渐老化而 进人休眠 状态,或者逐渐变褐死亡。引起的原因是生长素浓度太低,或是温度 过低或过高;生长太快型是接种后茎尖迅速增大,在茎尖基部产生愈伤组织,并 迅速增殖,而茎 尖不伸长,久之茎尖也形成愈伤组织,从而丧失发育成苗的能 力。 引起的原因一是生长素浓度过高, 引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。 二是光照太弱或温度 太高。生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈 伤组织,茎尖颜色逐渐变绿,并逐渐伸长,叶原基发育成可见的小叶,进而形成 小苗。 (2)培养条件 接种到培养基上的茎尖,置于培养室中培养,每天照光 16h, 照度 1500-30001x,温度通常在 25±2℃。并且应根据不同植物种类,或者随培 养过程的不同,给予适当的昼夜温差等处理。由于生长点培养时间较长,琼脂培

养基易于干燥,这可以通过定期转移和封严包口等加以解决。一般茎尖培养在 40d 左右可长成新梢,进行继代培养。 (3)继代培养 茎尖长成的新梢,可切成若干小段,转入到增殖培养基中。1 个月左右,新梢又可切成小段,再转入新培养基,这样一代一代继续下去,便建 立和维持了茎尖无性系。继代培养可用 MS 培养基。有时也可边进行继代培养边 进行诱导生根。 取比较长的新梢(如 1cm 以上)转人生根培养基,余下较短的新梢 进行继代培养。 (4)诱导生根 诱导生根通常采用 I/2MS 培养基, 。Bp MS 培养基的各种组成 成分用量均减半的培养基。并加入一定的生长素类调节物质,如 NAA、IBA 等。 也可将切下的新梢基部浸入 50 或 100×10-6 的 IBA 溶液处理 4-8h,然后转移到 无激素的生根培养基中。 注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。如果新梢周 龄较大、木质化程度较高,则用 IBA 处理的时间应适当延长或将其浓度提高。 (5)移栽入土 在生根培养 1 个月左右,多数新梢即可获得生长健壮而发达的 根系。移植时可根据生根情况来进行。若发现新梢基部生有较浓密的不定根,长 度在 lcm 以内,就可移栽人土。移栽时通过几天的炼苗过程,从试管中取出小植 株,轻轻洗掉培养基,栽入塑料营养钵或育苗盘中,营养钵盛经烧烤或常压灭菌 的培养土(1 分腐殖土:1 分沙)。 栽后给予较高的空气湿度条件。首先营养钵的培养土要浇透水,所放置的床 面也要浇湿,然后搭小拱棚,以减少水分的蒸腾,并且初期要常喷雾处理,保持 拱棚薄膜 上有水珠出现。当发现小苗有生长趋势,可逐渐减少湿度,将拱棚两 端打开通风,并且减少喷水次数。使小苗适应湿度较小的条件。以后揭去拱棚的 薄膜,并给予水 分控制,少浇水或不浇水,促进小苗长得粗壮。 温度管理上要掌握适宜的生根温度,最适宜的温度是 16-20℃,地温较低时, 可用电热线来加温。 光照管理上初期可用较弱的光照,在小拱棚上加盖遮阳网或 报纸等,以防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用,后期可直接利用自然光照。为了提 高驯化效率, 可用育苗盘进行驯化生根、 孔径选择 2cm 左右即可。 孔穴装入蛭石: 珍珠岩:草炭土为 1:1:0.5 的基质。当小苗长至 5cm 高左右再移人塑料营养钵 中。 二、茎段的培养 茎段培养指不带芽和带 1 个以上定芽或不定芽的,包括块茎、球茎在内的幼 茎切段的无菌培养。 培养茎段的主要目的是快繁。其次也可探讨茎细胞的生理特 点,以及进行育种上的筛选突变体的过程。 茎段培养用于快速繁殖的优点在于:培养技术简单易行,繁殖速度较快;芽 生芽方式增殖的苗木质量好,且无病,性状均一;解决不能用种子繁殖的无性繁 殖植物的快速繁殖问题等。 1、材料的选择和处理 取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘,若是木本, 取当年生嫩枝或一年生枝条,剪去叶片,剪成 3-4cm 的小段。在自来水中冲洗 1-3h,在于无菌条件下用 75%酒精灭菌 30-60s,再用体积为 0.1%/升的汞浸 泡 3-8min,或用饱和漂白粉浸泡 10-20min, 因材料老嫩和蜡质多少而定时间。 最后用无菌水冲洗数次,以备接种。取材时注意茎的基部比顶部切段,侧芽比顶 芽的成活率低,所以应优先利用顶部的外植体,但 由于每个新梢仅一个顶芽, 也可利用腋芽,茎上部的腋芽培养效果较好。还应注意尽量在生长期取芽,在休 眠期取外植体,成活率降低。如苹果在 3-6 月取材的成活率为 60%,7-11 月下 降到 10%,12-2 月都下降 10%以下。

2、培养 最常用的基本培养基为 MS 培养基,加入 3%蔗糖,用 0.7%的琼脂 固化。培养条件保持 25℃左右,给予充分的光照和光期。经培养后茎段的切口 特别是基部切口上会长出愈伤组织,呈现稍许增大,而芽开始生长,有时会出现 丛生芽,从而得到无菌苗。 在茎段培养中,促进腋芽增殖用 6-BA 是最为有效的,依次为 Kt 和 Zt 等。生 长素虽不能促进腋芽增殖,但可改善苗的生长。GA 对芽伸长有促进作用。 继代扩繁是茎段培养的主要一步。这可由二种途径解决:一是促进腋芽的快速生 长,二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异,能保持品种 优良特性。且方法简便,可在各种植物上使用,每年从一个芽可增殖 10 万株以 上。第二种途径会产生变异。 继代增殖过程注意选用培养基和生长调节剂。 生根培养的目的是使再生的大量试管苗形成根系,获得完整的植株。创造适 于根的发生和生长的条件· ,主要是降低或除去细胞分裂素而加人生长素。由于 在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素,并促使苗中保持着一定的量,因此, 在生根培养中不需要加细胞分裂素。 生长素的浓度, NAA 一般 0.1-1.0mg/L, IBA 和 IAA 可稍高。 试管苗的生根,对基本培养基的种类要求不严,如 MS,B5 White 等培养基, 都可用于诱导生根,但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中,除 White 外,都富含 N,P,K 盐,它们都抑制根的发生。因此,应将它们降低到 1 /2,1/3 或 1/4,甚至更低的水平。 生根培养时增强光照有利于发根,且对成功地移栽到盆钵中有良好作用。故 在生根培养时应增加光照时间和光照强度,但强光直接照射根部,含抑制根的生 长,所以在生根培养时最好在培养基中加 0.3%活性炭,以促进生根。 3、移植 这是组织培养的关键一环。试管苗是在恒温、保湿、营养丰富、 激素适当和无菌条件下生长的。植物的组织发育程度不佳,植株幼嫩,表皮角质 层变薄,抵抗力减小 减弱。移植是一个由异养转变为自养的过程。因此,在驯 化时要进行炼苗。然后洗净琼脂,小心移栽,初期湿度要大,基质通气湿润,保 湿保温,更要精心管理等。 第三 节 叶的培养 离体叶培养包括叶原基、 叶柄、 叶鞘、 叶片、 子叶在内的叶组织的无菌培养。 它大多经脱分化形成愈伤组织,再由后者分化出茎和根。 叶是植物进行光合作用的自养器官,又是某些植物的繁殖器官,因此叶培养 不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题,而且也是繁殖稀 有名贵品种的有效手段。 在自然界, 很多植物的叶都具有很强大的再生能力,能从叶片产生不定芽的 植物,以羊齿植物最多,双子叶植物次之,单子叶植物最少。再生成植株的方式 有二种:一种是直接诱导形成芽,另一种是先诱导形成愈伤组织,再经愈伤组织 分化成植株,叶的离体培养技术如下: 1、材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片冲洗干净,用 70%酒精漂洗约 10s, 再在饱和漂白粉液中浸 3~15min,或在 0.1%L 汞中浸 3-5min,用无菌水冲洗数 次,再放在无菌的干滤纸上吸干水分,以供接种用。对一些粗糙或带茸毛的叶片 要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。一般地说,同一叶片的栅栏组织比海

绵组织处于较成熟状态。 在培养叶肉时因为海绵组织在分裂前就死亡,如果栅栏 组织不发达的话就难于培养。 2、接种 把灭菌过的叶组织切成约 0.5cm 见方小块或薄片(如叶柄和子叶), 接种在 MS 或其他培养基上。培养基中附加 BA1-3mg/L,NAA0.25 mg/L。 3、培养 叶接种后培养条件为每天 10-12h 光照,光强 1500-30001x。培养 约 2 周至 4 周,叶切块开始增厚肿大,进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化 培养基上进行分化培养,分化培养基的细胞分裂素含量为 2mg/L 左右,约 10d 左右,愈伤组织开始转绿出现绿色芽点,它将发育成无根苗。若再将苗移至含 NAA0.5-lmg/L 的生根培养基可诱导成根,从而发育形成完整植株。叶的培养比 胚,茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织,如幼叶比成熟叶 易培养,子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素,保证利于 叶组织的脱分化和再分化。

第五章

胚胎培养

目的要求: (1)掌握胚培养和胚乳培养的操作步骤; (2)了解胚珠培养和子房培养的操作步骤 植物胚胎培养是胚及胚器官(如子房、胚珠)在离体无菌条件下,使胚发育成 幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。 胚胎培养已有近百年的历史,1904 年的 Haning 最早成功地培养了萝卜和辣 椒的胚,并萌发形成小苗。30 年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40 年 代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚 胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。 胚胎培养的意义 1、克服远缘杂种的不育性 在高等植物的种间和属间杂交后代胚败育,胚发 育不全而不能正常萌发, 因而得不到杂种种子,用胚胎培养和试管受精技术就可 以解决这些问题。 2、使胚发育不全的植物获得后代 如兰花、天麻的种子成熟时,胚只有 6-7 个细胞,多数胚不能成活。如在种子接近成熟时,把胚分离出来进行培养,就能 生长发育成正常植物。 3、缩短育种年限 在杂交育种中,应用胚培养技术可以缩短育种周期 1-2 年。 第一 节 胚培养 植物在受精后,受精卵形成合子,随即进行第一次分裂,进而形成分生 组织和幼胚,再发育成成熟胚。在这个过程,胚靠消耗胚乳的营养而发育,同时 胚处在胚囊环境中,可吸收氨基酸、维生素等营养。 一 、 培 养 类



离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚, 一般可分为成熟胚和幼胚 培养。 (1)成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功, 在含有无机大量元素和糖的培养基上,就能正常生长成幼苗。由于种子外部有较 厚的种皮包裹,不易造成损伤,易于进行消毒,因此,将成熟或未成熟种子用 70%酒精进行几秒钟的表面消毒,再用无菌水冲洗 3-4 次,然后在无菌条件下进 行解剖,取出胚并接种在适当的培养基上培养。 (2)幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚,由于幼胚培养在远缘杂交 育种上有极大的利用价值,因此,其研究和应用越来越深入和广泛。随着组织培 养技术的不断完善, 幼胚培养技术也在进步,现在可使心形期胚或更早期的长度 仅 0.1-0.2mm 的胚生长发育成植株。由于胚越小就越难培养。所以,尽可能采用 较大的胚进行胚养。现在幼胚培养成功的有大麦、荠莱、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。 二、培养过程 幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同, 值得注意的是切取幼胚必 须在高倍解剖镜下进行,操作时要特别细心,尽量取出完整的胚。在未成熟胚胎 的培养中,常见有三种明显不同的生长方式,一种是继续进行正常的胚胎发育, 维持"胚性生长";另一种是在培养后迅速萌发成幼苗,而不继续进行胚性生长, 通常称为"早熟萌发"; 第三种是在很多情况下,胚在培养基中能发生细胞增殖形 成愈伤组织,并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。特别是进行生长调节时, 就更为如此。 幼胚培养成功的关键, 是提供幼胚所必需的营养和环境条件。通常存在的影 响条件如下: 1、培养基 成熟胚对培养基要求不高,而幼胚要求较高,常用的培养基有 Tukey,MS,B5,Nitsch 培 养基,其中前者适于成熟胚培养,其他适于未成熟 胚和幼胚培养。幼胚需要较高的蔗糖浓度,以提供较高的渗透压,但由于幼胚在 自然条件下赖以生存的是无定形的 液体胚乳,并具有较高的渗透压,所以人工 培养基中要创造高渗透压的条件,使它可以调节胚的生长,阻止可能渗透压的影 响,并能抑制中早熟萌发中的细胞延长, 以及抑制胚的萌发,避免把细胞的伸 长状态转化为分裂状态。 2、生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同,如 IAA 可明显促 进向日葵胚的生长。IAA,Kt 的共同作用可促进荠菜幼胚的生长。一般认为 IAA 可使胚的长度增加,加入 BA 可提高胚的生存机会。 对荠菜胚的培养可以在一种简单的渗透压未调整的无机盐培养基中进行, 用 生长调节物质或增加蔗糖或主要盐类的浓度,不但可以诱导更小的胚的生长,而 且还可以 暗示渗透压与生长调节物质的复杂作用。显然,高渗透压的控制和生 长调节物质的化学调节, 应通过某种方式联系起来。另外在平衡的激素控制系统 中,一种或几种 成分的活性,依次被高浓度的蔗糖或高浓度盐所控制,即可通 过渗透过程阻止细胞伸长。 3、天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用,如番茄胚在含有 50%椰乳的培养基中可维持生长。另外对胡萝卜、幼小子叶阶段的离体胚培养, 也有促进作用。 另外还有一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力,可能是植

物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。 4、温光条件 对于大多数植物的胚来说,在 25-30℃为宜,但是,早熟果树 如桃的种胚,必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长,而马铃薯胚以 20℃为好。 另外,光照可以促进某些植物胚的转绿,利于胚芽生长,而黑暗则利于胚根 生长。因此以光暗交替培养较为有利。 5、其他条件 在胚培养中除要求有较高的蔗糖浓度、高渗透压以外,还要求 有较高浓度的氨基酸及无机盐。 第二节 胚乳培养 胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的 3 倍体组织。 由它可 获得无子结实的 3 倍体植株,进而可将它加倍成 6 倍体植株。 取授粉 4-8d 后的幼果,常规消毒后,在无菌条件下切开果实,取出种子, 小心分离出胚乳。接种在培养基上,可用 MS 、 White 等,加入 2 , 4-D 或 NAA0.5-2.0mg/L,BA0.1-1.0mg/L。 在 25-27℃和黑暗条件或散射光下培养,约 6-l0d 胚乳开始膨大,再培养形 成愈伤组织.这时应转到分化培养基上培养,分化培养基可加入 0.5-3.0mg/L 的 BA 及少量的 NAA。待愈伤组织长出芽后,切下不定芽,插人生根培养基中, 光下培养 10-15d,切口处可长出白色的不定根。 第三 节 胚珠和子房培养 胚珠培养是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后, 取出胚珠置于培养基培 养的过程。 有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。胚珠培养可以解决像兰科植 物成熟胚较小不易培养的问题。 另一方面在未受精的胚珠培养中,可诱发大孢子 发育成单倍体,用于单倍体育种。 对胚珠进行培养时, 首先从花中取出子房进行表面消毒,然后在无菌的条件 下进行解剖,取出胚珠,放在培养基上进行培养,基本培养基一般均用 Nistch 培养基,不过诸如 MS、N6、B5 等培养基也可采用。将胚珠培养成植株的关键是 选择胚的发育时期, 实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。另外为了培 养成功,可取用带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养。 本章小结 (1)植物器官培养是组织培养当中一个最重要的方面,应用范围最广泛。它 是指植物离体的根、茎、叶、花、果和种子的无菌培养。 (2)根培养不仅可以很方便地研究根的生理代谢,而且还可以再生成幼小植 株。 (3)花培养是指整个花器官或花的组成部分之一的无菌培养,基本培养基一 般用 MS 或 B5。 (4)种子无菌培养操作简便,植株分化容易,可以在一定程度上克服育种中 远缘杂交的不育性。 (5)胚胎培养包括:幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培 养等。胚胎的培养具有以下意义:①克服远缘杂种的不育性,②使胚胎发育不完 全的植株获得后代,③缩短育种年限,提高育种效率。 复习思考题 (1)为什么说植物器官培养是组织培养的一个最重要的方面?

(2)植物的离体根培养有何意义? (3)普通茎尖培养时, 怎样取材和处理外植体?在茎尖培养过程中会出现什么 现象?应怎样解决? (4)茎段培养与茎尖培养有什么主要区别? (5)花器官培养通常指花的哪些部分培养?常用的基本培养基是什么? (6) 植物胚胎培养分为哪些类型 ? 各有何特点和要求 ? 胚胎培养有何重要意 义?

第六章 花药和花粉培养 目的要求: (1)掌握花药培养和花粉培养的区别; (2)了解花药最佳接种时期; (3)掌握花药培养的大致过程; (4)掌握花粉发育的四种途径; (5)掌握花粉培养的大致过程。 花药是植物花的雄性器官, 包括体细胞性质的药壁和药隔组织,以及雄性性 细胞的花粉粒。按染色体的倍性来看,前者为二倍体细胞,后者为单倍体细胞。 因此,花药培养属器官培养,花粉培养属细胞培养,但花药培养和花粉培养的目 的一样,都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞,最后发育成单倍体植株。 花粉培养和花药培养都指在合成培养基上,改变其发育机能,即不经过受精 发生的细胞分裂, 由单个花粉粒发育成完整植物。由于都能获得同花粉染色体构 成相同的 单倍体植株,经染色体加倍而成为正常结实二倍体植株。所以后者属 于真正的纯系。这和常规多代自交纯化方法相比,可节省大量的时间和劳力。同 时,花药和花粉 培养是研究减数分裂,花粉生长机制的生理、生化、遗传等基 础理论的最好方法。 从 70 年代开始,我国花培研究进展很快,包括水稻、小麦、烟草、玉米、 橡胶、杨树、辣椒等几十种作物,其中烟草新品种是世界上第一个用单倍体方法 培养出来的新品种。 第一节 花药和花粉培养技术

花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上, 来改变花粉的发 育程序,使其分裂形成细胞团,进而分化成胚状体,产后再生植株,或形成愈伤 组织,由愈伤组织再分化成植株。 一、花药材料的选择 在正常情况下,花药中的花粉母细胞经过减数分裂形成 4 个 花粉粒,开始 时连在一起,外有透明的胼胝体包围。经进一步发育后,细胞体积增大,形成外 壁并出现萌发孔,此时细胞核较大居中,称单核中央期。随着细胞体积 迅速增 大,细胞核由中央位置推向一边,即单核靠边期。以上均为单核期花粉。单核花 粉经第一次有丝分裂后, 形成一个营养核和一个生殖核, 即二核花粉。 生殖核 再 分裂一次,产生两个精核,即三核花粉最适宜的花药发育时期,因植物种和品种 而不同。 但大多数是单核期。 根据细胞观察推测, 双核期的花粉中开始积累淀粉, 不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染色,再压片镜检,以确定 花粉的发育时期。但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检, 通常 是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性,在实际操作中取一定大小 的花蕾进行的。如水稻选择剑叶叶枕抽出距下一叶,叶枕约为 4~6cm 的孕穗稻。 二、培养基的选择 花药培养所采用的培养基是 MS、N6、B5 等。添加的激素有 6-BA、KT 和玉米 素,2,4-D,NAA 和 IAA 等。诱导愈伤组织的培养基可添加 2,4-D,其浓度为 1~3mg/L, 分化培养基可添加 2~3mg/L 的 BA,再加少许的 IAA(0.2~0.5mg/L), 生根培养基可单独添加生长素(0.5~lmg/L)。 花药培养在某些情况下,可不经愈伤组织阶段,直接产生胚状体。这是最理 想的方式,这样可以免去愈伤组织和生根阶段。但多数情况下是产生愈伤组织, 这时尚需要 进一步转移到分化培养基中,诱导分化产生芽,这时要应用分化培 养基,提高细胞分裂素的浓度,降低生长素的含量,甚至不用生长素。 基本培养基中的蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用。 在辣椒花药培养中 以 6 %的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。在番茄花药培养中需要量高达 14%。 其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故,即高浓度的蔗糖 不利于药壁、花丝等体细胞的生长,而利于花粉的生长。 三、消毒接种培养 由于花药消毒比较简便, 所以应从健壮无病植株中采集花蕾,因为未开放的 花蕾中的花药为花被包裹,本身处于无菌状态,可仅用 70%酒精棉球将花的表 面擦洗即可。也可按对其他器官消毒处理方法进行,先用 70%的酒精浸一下后, 在饱和漂白粉溶液中浸 10~20min,或用 0.1%升汞液消毒 7~lOmin,然后用无菌 水洗 3~5 次。 花药在消毒前,也可进行预处理,将花蕾剪下放入水中,在冰箱 4~5、下保 持 3~4d。低温贮藏后,花药容易发生胚状组织。接种时把花蕾用解剖刀、镊子 小心剥开花蕾,取出花药,注意去掉花丝,然后散落接种到培养基上,一个 l0ml 的试管可接种 20 个花药。 培养温度在 23~28℃左右,每天 11~16h 的光照,光照强度 2000~4000Lx。 脱分化培养时,可用 MS+2,4-D 的培养基,或 N6+2,4-D 的培养基,经 10~30d, 可诱导生成愈伤组织,或少数生成胚状体。愈伤组织增殖到 1~3mm 左右时,应转 移到加有细胞分裂素和微量生长素的新的分化培养基上,再经 20~30d,可获花 粉植株。 胚状体为类似于胚的组织,它经过原胚、球形胚,然后循着与合子胚相似的

发育顺序,即心形胚、鱼形胚、子叶期的顺序继续分化形成小植株。由于此途径 避免了经 由愈伤组织这一复杂过程,可直接由花粉形成胚状体,免去生根阶段, 具有保持遗传稳定性,发育速度快的特点,所以越来越受人们研究的重视。当然 胚状体也可由 愈伤组织产生。 培养花药是直接产生胚状体还是产生愈伤组织, 主要取决于培养基中激素的 状况。 一种植物的花药可以在一种培养基上长幼苗,而在另一种培养基上则形成 愈伤组织。 如水稻通常在含有生长素的培养基上诱导出愈伤组织,而在不含任何 激素的 N6 培养基上长出胚状体。但在辣椒的花药培养中,只要培养基合适,甚 至可以在同一花药上一部分花粉形成胚状体,而另一部分只形成愈伤组织。 四、花药培养中的花粉发育过程 植物中只有少数用离体花粉培养直接产生植株, 而大多数是用离体花药培养 来产生花粉植株, 这是因为花药壁可以在培养中提供某些生长发育物质。离体花 药培养采用人工控制培养的方式,改变了花药自熟发育的途径,其花粉的发育大 致有下列几种途径。 1、营养细胞发育途径 在花药离体培养中, 花粉第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核。生 殖核较小,一般不分裂或只分裂 1~2 次,就逐步退化。而体积大的营养核经多次 分裂且形成了细胞壁,最后变成了多细胞团,迅速生长,很快突破细胞壁,细胞 团不断分裂,穿破药壁,可以产生胚状体或愈伤组织。 2、生殖细胞发育途径 在这种途径下, 营养核只分裂 1~2 次就退化了,而生殖核经多次分裂发育成 多细胞团。 3、营养细胞和生殖细胞同时发育的途径 花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂,因此最 后形成的多细胞团包括两部分, 一部分细胞较大的是由营养细胞分裂而来;另一 部分细胞较小的是由生殖细胞分裂而来。 4、花粉均等分裂途径 花粉进行均等分裂形成两个均等的子核,以后二核间产生壁,形成两个子细 胞,由两个子细胞形成多细胞团,迅速生长,穿破药壁而形成胚状体或愈伤组 织。 五、 花粉的培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来, 以单个花粉粒作为外植体进行离体 培养的技术。 由于花粉已是单倍体细胞,诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植 株都是单倍体植株。且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是 较比花粉培养难度大。 1、花粉的分离 取新鲜未开的花蕾用自来水冲洗 10min,用 75%的酒精消毒 10~15min, 无菌水冲洗 2 次,再用 10%漂白粉上清液浸泡 20min,无菌水冲洗 3~4 次。然后 将花药放到加有基本培养基的小烧杯中,用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花 药,使花粉从花药中释放出来。用尼龙筛过滤掉药壁组滤液再经低速离心 (100~160r/min),上面的碎片可用吸管吸掉,再加入新鲜培养基。连续进行两 次过滤,到每毫升含 103~104 个花粉的浓度就可以了。 简单的方法是花粉从花药中挤出后,用镊子取出花粉空壳,放在培养基上培 养。此法适于微室栽培,但往往有药壁等体细胞混入。

2、花粉的预处理 花粉经过预处理不但有利于改变正常的发育途径, 而且还可以促进花粉植株 的形成。 (1)低温处理 低温处理通常是常用也是效果比较好的一种处理方法。 在花粉第一次有丝分 裂期进行低温处理时,在黑暗条件下以植株、花蕾、花粉、花药等作材料比较, 以处理分离的花蕾效果最好。 (2)重力的作用 在烟草花粉培养中,在从花蕾中取出花药前 1h,在 5℃条件下进行低温 离心机离心,可提高单倍体的诱导率。另外,在玉米上试验也有同样效果。 3、培养基成分 在花粉培养中可添加一些物质,有促进生长的作用。培养基选用 Nitsch 作 基本培养基,含有诸如硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等。 六、花粉培养方法 1、微室培养法 取含有 50~80 粒花粉的一滴培养液放在微室培养装置中,为了防止花粉破 裂,应在低温条件下(4℃以下)接种,然后在 20℃下培养。 2、看护培养法 在装有 50ml 液体培养基的小培养皿中,用解剖针撕开花药释放出花粉,形 成花粉悬浮液,最后稀释至 0.5ml 培养基中,含有 10 个花粉粒的细胞悬浮液。 看护培养时, 把花药放在琼脂培养基表面上,然后在每个花药上覆盖一小块圆片 滤纸。用移液管吸取 l 滴已准备好的花粉粒悬浮液,滴在每个小圆片滤纸上。培 养在 25℃和一定光照强度下,大约一个月长出细胞群。由于完整的花药发育过 程释放出有利于花粉发育的物质,并通过滤纸供给花粉,促进了花粉的发育。 培养的花粉形成胚有两个途径:一是花粉核分裂产生营养核和生殖核,以后 生殖核退化,营养核则继续分裂 2~3 周,形成多核花粉,由此形成多核的原胚; 二是花粉核直接分裂,再形成胚。 本章小结 (1)花药培养是器官培养,花粉培养属细胞培养,但二者培养目的是一样, 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞,最后发育成单倍体植株。 (2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种,因为这一时期尚没有淀粉的 积累。 (3)花药培养包括:选择材料-消毒-接种培养-愈合组织生成-分化出单倍体 植株。 (4)花粉的发育途径包括:营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞 同时发育及花粉均等分裂发育途径。 (5)花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。 复习思考题 (1)花药培养和花粉培养有何区别? (2)花药培养时选择什么发育时期的花药?为什么? (3)花药培养时培养基配制有什么特点? (4)花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养。

第七章 原生质体的培养 目的要求: (1)了解原生质体培养的意义; (2)掌握原生质体分离的大致步骤; (3)掌握原生质体培养的方法; (4)掌握原生质体融合的方凑。 一、原生质体(protoplast) 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分, 是能存活的植物细胞的最小 单位。自从 1960 年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来,原生质体 培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明,没有细胞壁的原生 质体仍然具有"全能性", 可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究 较早,1892 年 Klereker 首先用机械的方法分离得到了原生质体,但数量少且易 受损伤。1960 年,英国植物生理学家 Cocking 首先用酶解法从番茄幼苗的根分 离原生质体获得成功。 他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶 溶液降解细胞壁。然而,直至 1960 年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以 后, 植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都 可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等 70 种植物 的原生质体再生成完整的植株。此外,原生质体融合,体细胞杂交的技术也得到 广泛的应用。 二、原生质体培养的意义 1、再生植株 由原生质体再生生成植株,不论在进行有关细胞生物学或生物 合成和代谢的实验研究上,还是在组织培养实践中,都有一定的优点:①可利用

均一的分化细胞群体; ②因无细胞壁,试剂对细胞作用更为直接,其反应能直 接测量, 以使反应产物能较快的分离出来; ③在理论和实践中, 可极大节省空间, 如在一个三角瓶就能培养 210 个细胞,但在大田种植需要 4 亩地;④可缩短实验 周期,如悬浮培养时仅需 1~2 个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补, 不亲和性, 连锁群和基因鉴定, 分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时,用一个均一的原生质体 群体可以筛选数以千计的不同。 营养和激素条件, 探索诱导单细胞的分化条件等。 2、用 于远缘体细胞融合,进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法, 为人们提供新的育种方法。 两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成 功的,而用细胞 融合的方法却成为可能。首先,两个原生质体融合形成异核体, 异核体再再生细胞壁,进行有丝分裂,发生核融合,产生杂种细胞,由此可培养 新的杂种。 第一节 原生质体的分离与纯化 要分离植物原生质体, 必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构 成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞,愈伤组织和液体 悬浮培养 细胞置于高渗的糖溶液中,使之质壁分离,原生质体收缩成球形。然 后用剪刀剪碎组织, 就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分 离的原生质体太 少,而且只能适于部分组织,Cocking 发明的酶解法,开创了 大量分离原生质体的新技术,所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。 一、植物材料 一般来说,植物各个器官,如:根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和 悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是,要获得高质量的原生质体,则 须选用生长旺盛、 生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决 定性因素之一。 1.细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前,需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未 成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶,经无菌消毒后,在 26℃黑暗条件下,在 含 2,4-D2~4mg/L 的 MS 固体培养基上,诱导愈伤组织,每隔 2~4d 转接一次。 从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织,或经继代培养一次后,转移到液体 培养基的 l00ml 三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器,速度控制 在 80~120r/min,在 25 土 1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔 3d 继代一次,一 个半月后,吸取 4~5ml 悬浮细胞转到 250ml 三角瓶的 40ml 新鲜培养中,以后每 隔 7d 继代一次。 通常经悬浮培养 3~4 月后,悬浮培养细胞的大小变得较为一致, 且细胞质变得较浓时,可用作分离原生质体。 2.叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料,用叶片的薄壁组织作为材 料来源, 既要考虑植株的生长环境,又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质 体分离的影 响。取生理状态适宜的叶片,有利于原生质体的细胞再生和细胞分 裂。要获得良好的培养材料,下列外界因素是考虑的重要因子: (1)光强为 3000-6000Lx。 (2)温度为 20~25℃培养。 (3)相对湿度在 60%~80%左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体,如用花粉四分体和花粉壁细胞。

3.植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率; 也可以逐步提高植 物材料的渗透压, 以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括: 暗处理、 预培养、 低温处理等。把豌豆的枝条取下后,在分离原生质体前,先让材料在黑暗中的一 定湿度条件下放 1~2d,这样得到的原生质体存活率高,并能继续分裂;在羽衣 甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中,先去掉叶片的下表皮,再在诱导愈伤组织 的培养基中预培养 7d,然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡 化,叶绿体也解体;龙胆试管苗的叶片只有用 4℃低温处理后分离得到的原生质 体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 二、酶 1、酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是: ①纤维素, 占细胞壁干重的 25%至 50% 不等;②半纤维素,平均约占细胞壁干重的 53%左右;③果胶质,一般占细胞 壁的 5%。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂,主要含有纤维素酶 C1, 作用于天然的和结晶的纤维素,具有分解天然纤维素的作用,还含纤维素酶 Cx, 作用于定形的纤维素,可分解短链纤维素,另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄 聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等,总体作用是降解纤维素, 得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的, 使细胞间的果胶质降解,把细胞从组织内分离出 来。 半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。 此外, 还有蜗牛酶, 主要用于花粉母细胞和四分体细胞。 ZA3-867 纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取 制成的,粗制品是多种酶的复合物,含有纤维素酶(包括 C1、Cx、B-葡萄糖苷酶 等),果胶质,半纤维素酶等,分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需 加半纤维素酶和果胶酶等, 就可以分离出植物原生质体。日本产的 Onozuka 纤维 素酶常和果胶酶结合使用,可先用果胶酶降解果胶,使分开细胞,再用纤维素酶 处理降解细胞壁。即二步法降解。 2、渗透稳定剂 植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。 去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压 和细胞内的渗透压不同,原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养 液中渗透 压应大致和原生质体内的相同,或者比细胞内渗透压略大些。渗透压 大些有利于原生质体的稳定,但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此,在分离原生质体的酶溶液内,需加入一定量的渗透稳定剂,其作用是 保持原生质体膜的稳定,避免破裂。常用的两种系统为:①糖溶液系统:包括甘 露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等,浓度约在 0.40~0.80mol/L。本系统还可促进 分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂; ②盐溶液系统: 包括 KCl、 MgS04 和 KH2PO4 等。 其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响,因而材料不必在严格的控 制条件下栽培,不受植株年龄的影响,使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。 另外,添加 牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多 采用在盐溶液内进行原生质体分离, 然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培 养。 此外, 酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾, 它可提高原生质体的稳定性。 这种物质可使 RNA 酶不活化,并使离子稳定。

3、酶溶液的 pH 值 酶溶液的 pH 值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养 材料时,发现原始 pH 值为 5.0 时, 原生质体产生得很快,但损坏较严重,并且 培养后大量破裂。当 pH 值提高到 6.0 时,最初原生质体却产生少,但与 pH 值为 5.0 时处理同样时间后相比,原生质体数量显著增加。原始 pH 值提高到 7.0 时 生活的原生质体数量进一步增加,损伤的原生质体也少得多。 三、原生质体的分离 分离原生质体时, 首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去, 因此, 一般先将材料分离成单细胞,然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织,或将 组织切成薄片等方法,都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是"一步法",即把一定量的纤维素酶,果胶酶和半纤维 素酶组成混合酶溶液, 材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植物材料 须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体,一般去表皮的叶片需酶量较少, 而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液 10~30ml 不等。 由于不同材料的生理特点不同,在研究游离条件时,必须试验不同渗透压浓 度的细胞,找出适宜的渗透浓度。例如,游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中 须加入 0.55mol / L 甘露醇,游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加 0.4~0.45mol/L 的甘露醇,两者差别较大。 酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉, 将去表皮的一面朝下放 入酶液中。去表皮的方法是:在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。 如果去表皮很困难,也可直接将材料切成小细条,放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料, 如果细胞团的大小很不均一,在酶解前最好先用尼龙 网筛过滤一次,将原细胞团去掉,留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。 酶解处理一般地在黑暗中静止进行,在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于 悬浮细胞,愈伤组织等难游离原生质体的材料,可置于摇床上,低速振荡以促进 酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是,时间 过长对原生质体有害,所以一般不应超过 24h。酶解温度要从原生质体和酶的活 性两方面考虑。对于这几种酶来说,最佳处理温度在 40~50℃.但这个温度对植 物细胞来说太高,所以一般都在 25℃左右进行酶解。 若用叶片作为材料,取已展开的生活叶片,用 0.53%次氯酸钠和 70%酒精 进行表面灭菌,然后切成 2cm 见方。把 4g 叶组织置于含有 200ml 不加蔗糖和琼 脂的培养基 500ml 三角瓶中。 在 4℃黑暗条件下培养 16~24h,以后叶片转入含有 纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中,pH 值为 5.6,通常在酶液中使 用的等渗剂为 0.55~0.6mol 甘露醇。然后,酶液真空渗入叶片组织。在 28℃条 件下,每分钟 40 转的旋转式转床上培养 4h 后,叶片组织可完全分离。 若用悬浮培养细胞, 可不经过果胶酶处理,因为悬浮细胞液主要由单细胞和 小细胞团组成。取悬浮细胞放人 10ml 的酶液中(3%纤维素酶,14%蔗糖,pH 值 5.0~6.0),在 25-33℃条件下酶解 24h。原生质体-酶混合液用 30um 的尼龙网过 滤,通过低速离心收集原生质体。 四、影响原生质体分离的因素 1、酶制剂活力和纯度 粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质,它们对原生质体的活力是有害 的。因此,在使用之前须将这些酶纯化,一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶 的活性还与 pH 值有关。Onoznka 纤维素酶 R-10 和离析酶 R-10 的最适宜 pH 值分

别为 5~6 和 4~5。不过实际上酶溶液的 pH 值经常调节 4.7~6.0 之间。 2、渗透稳定剂的作用 在分离原生质体时, 渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶 液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁,并使之能继续分裂,其缺点是有抑制 某些多糖 降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格,且使原 生质体稳定,使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁,同时使分裂后 细胞是分散的。 五、原生质体的净化和活力测定 在分离的原生质体中,常常混杂有亚细胞碎片,维管束成分,未解离细胞, 破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。 此外,还需去掉酶溶液。以净化原生质体。 原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法,步骤大致如下: 1、将原生质体混合液经筛孔大小为 40~100/tm 的滤网过滤,以除去未消化 的细胞团块和筛管、导管等杂质,收集滤液。 2、将收集到的滤液离心,转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液 中为准,一般以 500r/min 离心 15min。用吸管谨慎地吸去上清液。 3、将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外,其他成分和酶液 相同),再次离心,去上清液,如此重复三次。 4、用培养基清洗一次,最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一 般原生质体的培养密度为 104~106/ml。 在原生质体培养前, 常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性 有多种方法,如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯(FDA)染色等。 这些方法各有特点,但现在一般用的是 FDA 染色法。FDA 本身无荧光,无极性, 可透过完整的原生质体膜。 一旦进入原生质体后,由于受到脂酶分解而产生有荧 光的极性物质荧光素。 它不能自由出入原生质体膜,因此有活力的细胞便产生荧 光,而无活力的原生质体不能分解 FDA,因此无荧光产生。FDA 染色测活性的方 法如下: 取洗涤过的原生质体悬浮液 0.5ml,置于 10×100mm 的小试管中,加入 FDA 溶液使其最终浓度为 0.01%,混匀、置于室温 5min 后用荧光显微镜观察。激发 光滤光片用 QB24,压制滤光片用 JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的,不产 生荧光的为无活力的。 由于叶绿素的关系,叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力 的,发红色荧光的为无活力的。 第二节 原生质体培养 将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养, 很快就开始出现 细胞壁再生和细胞分裂的过程。约 1~2 个月后,通过细胞的持续分裂,在培养基 上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到 2-4mm 左右,即可转移到分化培养基上, 诱导芽和根长成完整的植株。 一、培养原生质体的方法 原生质体的培养方法大体和细胞培养相同,有固体培养、液体培养及周液结 合培养等几种方法。 1、固体培养法 该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合, 使琼脂的最终浓度为 0.6%左右,冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于

原生质体被机械地彼此分开并固定了位置, 避免了细胞间有害代谢产物的影响并 便于定点观察,追踪单个细胞的发育过程。 饲养培养是固体培养法的引伸。 将一些射线处理过的原生质体用一薄层琼脂 培养基固定在下层, 而活的原生质体固定在上层。这种方法允许原生质体密度低 于能生长的密度,因为它们可以从被处理过的原生质体那里获得一些有益的物 质。 固体共培养方法也是饲养培养的一种方式, 即把一种已知能快速生长的原生 质体和一种难以培养的原生质体相混合,然后用琼脂培养基固定共同培养。这种 方法使难以培养的原生质体得益于快速生长的原生质体所产生并易扩散的物质。 由于琼脂熔点较高, 因此, 在固定培养中保持琼脂培养基较高的温度和相对 剧烈的摇动是使原生质体在培养基中分布均匀的前提。此外,琼脂对原生质体是 有毒害 的,只能是一些生命力较强的植物原生质体才可以用这种办法来培养。 为此,人们不断寻求低毒并可在常温下凝固的物质来代替琼脂, 近年来很多实验证明, 琼脂糖是一个良好的培养基凝胶剂,它不仅具有熔点 低的特点,而且具有促进原生质体再生细胞分裂的作用;从对琼脂糖、琼脂及经 过漂洗的 纯净的琼脂的比较试验来看,发现尽管纯净的琼脂可以提高一些原生 质体的植板率, 但最好的结果是在琼脂糖上取得的,并且琼脂糖适用于广泛的植 物中。他们发现 在琼脂中不能分裂的天仙子属的品种能在琼脂糖中能持续分裂 并且比在液体培养基中形成细胞团的频率高。在琼脂糖培养基中,烟草原生质体 发育到细胞团所需的接 种密度要比在琼脂或液体培养基中的低。在水稻原生质 体培养中也证实,提高琼脂糖的浓度可以明显地提高原生质体引起的出芽现象, 从而提高了培养初期的原生质 体的成活率。因此,琼脂糖作为一种优良的凝胶 剂,在原生质体培养中的应用越来越广泛。 2、液体培养 液体培养法是在培养基中不加凝胶剂,原生质体悬浮在液体培养基中,常用 的是液体浅层培养法, 即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方 法操作简 便,对原生质体伤害较小,日便于添加培养基和转移培养物,是目前 原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。 其缺点是原生质体在培养基中分布不 均匀, 容易造成 局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的生长发育.并且 难以定点观察,很难监视单个原生质体的发育过程。 在固体培养法中提到的饲养培养和共培养,也可以用于液体培养的方法。 微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培养液用滴管以 0.1ml 左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿卜.由于表面张力的作用,小 滴以半球型保持在培养皿表面,然后用 Paratilm 封 口,防止干燥和污染。如果 把培养皿翻转过来,则成为悬滴培养。由于小滴的体积小,在一个培养皿中可以 做很多种培养基的对照实验。如果其中一滴或几滴发生污 染,也不会殃及整个 实验。同时也容易添加新鲜培养基。其缺点也是原生质体分布不均匀,容易集中 在小滴中央。此外由于液滴与空气接触面大,液体容易蒸发,造 成培养基成分 浓度的提高。解决蒸发问题最简单的办法就是在液滴上覆盖矿物油。 有些研究工作需要进行单个原生质体培养。 如选择出特定的原生质体和经融 合处理后数量很少的融合体等。 已有实验证实,单个原生质体的单独培养的关键 在于培养基原体积要特别小。 如油菜单个的原生质体须培养在 50ml 的培养基中, 这种比例相当于每毫升培养基有 2X104 个原生质体,在这种条件下,原生质体的 再生细胞可以持续分裂直到形成愈伤组织。这样小体积的微滴,是极易蒸发的,

为此,Koopt 设计了一个特殊的装置:首先,在一个长度为 3350um。并绝对洁净 的盖玻片上滴 50 滴 2.0mol/L 蔗糖小滴,每滴 1ul,分布成 10 行,每行的距离 为 3.4um。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下,使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部 盖玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的矿物油滴相互连通。硅化后,用水小心 地把蔗糖液滴洗去, 然后使盖玻片干燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域 加上 1um 的矿物油滴,再把已悬浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴 中。这样制备好的盖玻片放到一个双环培养皿中,培养皿的外环加满 0.2mol/L 的甘露醇溶液, 最后封口。 由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小 室中,保证了微小培养基不会蒸发,从而可以达到单个原生质体培养的目的。 二、固液结合培养法 最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体 培养基,再在其上进行原生质体的液体浅层培养。这样,固体培养基中的营养成 分可以慢慢 地向液体中释放,以补充培养物对营养的消耗,培养物所产生的一 些有害物质,也会被固体部分吸收,对培养物的生长更有利。已证明这种方法对 烟草和矮牵牛原生 质体的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效地吸附 培养物所产生的有害物质, 在下层固体培养基中添加活性炭,结果使原生质体形 成细胞团的数量提高了 23 倍。由于很多实验已证实了琼脂糖比琼脂更适于原生 质体培养, 近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培养相结合的方法。用几种植 物的原生质体做实验,发现尽管琼脂 糖提高了植板率,但到细胞团阶段后就难 以再继续发育。 这可能是由于培养物把固体培养基中的营养耗尽所造成的。他们 发展一种"念珠培养"法, 即把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积的 液体培养基中, 并在旋转摇床上振荡以利于通气。使用大体积的液体是为了防止 琼脂糖块过渡破碎。用这种方法.不仅进一步提高一些种(如番茄原生质体)的植 板率, 而且使一些以前从来超过细胞团阶段的种,如芜菁和矮牵牛原生质体能够 持续地分裂。 在水稻原生质体培养中使用的琼脂糖泡培养法也是固液结合的一个 好方法。把含有原生质体的琼脂糖念球养基以大约 50ul 一滴,滴在直径 5.5cm 的培养皿中,待其固化后,再向其中添加 3ml 液体培养基。这样,琼脂糖滴就处


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