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免疫细胞体外诱导及培养


过继性 T 细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点,但对 MHCI 类分子阴性 的肿瘤细胞无效,而 NK 细胞(Natural killer cell,NK 细胞)由于表达 MHCI 类分子 的抑制性受体 - 杀伤细胞抑制性受体 (Killer inhibitory receptor,KIR) ,可以杀灭 MHCI 类分子阴性的肿瘤,随着对 NK 细胞研究的深入,目前 NK 细胞用于肿瘤 免疫治疗成为研究热点。19 世纪 80 年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患 者一个新的希望。自然杀伤(natural killer, NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线, 再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信 号决定,所以 NK 细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。 自然杀伤细胞表面标志与分类 1. 依据表面标志分为 CD56bright 和 CD56dim 两个亚群 NK 细胞表达众多表面 分子,但只具有相对特异性。通常将 CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴样 细胞定为 NK 细胞, 并以 CD56 的表达密度不同, 将 NK 分为 CD56bright 和 CD56dim 两群。 CD56bright NK 细胞高表达 CD56、 CD94/NKG2A 和 L 选择素(CD62L); 低表达 CDl6 和 KIR;表达高亲和力的 IL2 受体(1L-2RapY)。而 CD56dim NK 细 胞高表达 CDl6、PEN5、KIR 和 LFA―1;低表达 CD56,CD94/NKG2A;仅 表达不带。链的中亲和力的 IL-2 受体(IL-2Rβγ)。

NK 细胞亚群 CD56bright 和 aD56dim 的表型特点

2.依据细胞因子分泌格局分为 NKl 和 NK2 两个亚群 NK 细胞也存在着类 似 Thl 和 Th2 样的亚群。分离外周 CDl6+,或 CD56+细胞,用 ILl2 和抗 IL―4 抗体可以诱导出分泌 IFN―Y 的 Thl 型 NK 亚群, 用 IL4 和抗体诱导出分泌 IL5、 ILl3 的 Th2 型 NK 细胞亚群,分别命名为 NKl 和 NK2。也有人认为 NK 细胞发 育经历 K2 一 NK0 一 NKl 的过程。在这一过程中 IL4 促进 NK2 增殖;ILl2 促 使 NK2 向 NKl 转变,并促进 NKl 的或熟。 3.依据黏附功能分为黏附 NK 和非黏附 NK 两个亚群 根据 NK 细胞在 IL2 的诱导下表现出的黏附能力, 分为黏附 NK(A―NK)和非黏附 NK(NA―NK)两个 亚群。A―NK 细胞的表型比较均一,主要为 CD3―CD56dim CDl6 十 IL2R+,不 含 CD56bright 细胞。NA―NK 细胞是具有不同表型的异质性群体,各种表型如 CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6 十、CDl6―均可存在。 方法: 1.采取 10 例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科 10 例 AML 患者外周血 15ml,运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞,分别放于含有 SCGM 培养基

的培养孔中培养, 前 5d 加入 0.5ulCD3McAb, 在培养的第 5d, 倒掉含有 CD3McAb 的培养液, 加入含有 rhIL-2 的 SCGM 培养基。 隔日补充一次培养液, 直至第 25d 。 2.运用细胞计数仪检测培养第 0d、5d、10d、15d、20d 及第 25d 的细胞数量及细 胞存活率。 3.运用流式细胞仪检测培养第 0d、5d、10d、15d、20d 及 25d 细胞中的 NK 细胞 百分率和 T 细胞百分率。 4.采用比色法检测培养第 0d、5d、10d、15d、20d 及 25d 分选出的 NK 细胞对 K562 细胞和 RPMI8226 细胞的杀伤活性。 健康志愿者即健康人群 NK 细胞的最佳培养时间间期是 20d。 1.细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 于培养的第 1,4,7,10 和第 14 天分别取细胞,充分洗涤,以 1× 10
6

/ml 浓度

加入 96 孔平底板中,每孔 0.2ml,设 3 个复孔,培养箱中培养 48h 后,每孔加 MTT (5mg/ml) 20ul, 继续培养 4h, 然后翻板, 每孔滴加 100ul 二甲基亚砜 (DMSO) 轻轻振荡 10min 后在酶标仪上 570nm 处测定吸光度(OD 值) ,取 3 孔均值,OD 值高则增殖快。 2. 细胞杀伤活性的测定采用 MTT 法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定 靶细胞为 Anip973 和 K562 肿瘤细胞, 效应细胞为完全培养基和 AIMV 分别培养 的 A-NK 细胞和 NA-NK 细胞,效靶比例为 100:1。设立效应细胞和靶细胞共同 孵育孔(E+T) ,效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T) ,每组设 3 个复孔, 操作方法同 1.4。 测定的 OD 值, 取 3 孔均值, 公式如下 [2] :细胞杀伤活性 (%) =[1+(OD E+T -OD E )/OD T ]× 100. 3. 细胞表型分析 细胞诱导 3~5h 后,分别收集完全培养基和 AIMV 培养的 A-NK 细胞和 NA-NK 细胞,按 5× 10 5 个细胞/管,用美国 Becton-Dickinson 公司的流式细胞仪检测并 分析 CD11 c 的表达。 4. 透射电镜标本制备 在培养瓶中将 A-NK 细胞和 K562 肿瘤细胞共同培养,过夜,第二天取出离心 (4000rpm× 5min) , 用 3%戊二醛固定 30min(37℃)后按常规处理电镜标本。 目的: 通过改进培养基及细胞因子体系从而制订更优的 NK 细胞体外培养扩增方 案,为临床 NK 免疫细胞治疗提供实验依据。 方法: 4 例血细胞分离机单采的新鲜白细胞及 3 例复苏的 G-CSF 动员后的外周血 造血干细胞(PBSCs),通过破红、 去血小板、弃贴壁细胞等处理,调节悬浮细胞浓度

至 5× 106/ml,添加细胞因子(包括 1000U/ml rh IL2、10ng/ml rh IL12、10ng/ml rh IL15、10ng/ml rh IL21)后培养于 37℃5%CO2 孵箱中 6 天。根据不同培养基及是 否添加 rh IL-18 将实验组分为 AIM-V± rh-IL18 组及 SCGM± rh-IL18 组,rh IL-18 浓 度为 20ng/ml。每隔 2~3 天半量换液,调节细胞浓度至 2× 106/ml,并补充相应细胞 因子。收集培养到第 3 天(D3)及第 6 天(D6)的细胞进行计数、NK 纯度及功能表 型检测。 结果: SCGM+rh IL18 相比 AIM-V 组能使 NK 细胞扩增能力明显增强,培养到 D6 天 NK 细胞绝对值上调 4~8 倍,NK 纯度提高 10%~20%(P0.05)。培养到 D6 天 时,SCGM+rh IL18 相比 AIM-V 组能使 NK 细胞的穿孔素、颗粒酶的表达分别上 调(19± 4)%及(10± 4)%(P0.05),迁移表型 CD62L 及成熟表型 CD57 的表达分别上调 (12± 4)% 及 (7± 2)%(P0.05) 。而且 SCGM+rh IL18 能使 NK 细胞分泌更高水平 IFNγ(P0.05)。另外,NK 细胞的功能表型及分泌 IFNγ 的能力随着培养时间的延长 明显递增(D6D3D0)(P0.05)。 结论:本实验证明 SCGM 培养基联合 IL-12/15/18 是体外培养制备 NK 细胞的更 好策略,能进一步提高 NK 细胞的纯度、绝对值、功能表型及分泌 IFNγ 的能力。 本实验为临床上同种异体 NK 细胞治疗移植后复发 AML 提供了理论依据:有望 进一步提高 GVL 效应并减少 GVHD 发生。 恶性肿瘤所致的死亡率中,白血病在男性中居第六位,女性中居第八位,儿童及 35 岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷 获得缓解;移植和免疫治疗。CTL (Cytotoxic T cell, CTL)细胞目前在血液临床 方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。 根据移植物的来源不 同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无 G VHD,移植后生活质量较高,但因无 GVLE (graft-versus gost effect,,GVLE), 易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身 CTL 细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移 植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的 CTL 细胞,复发 问题可能会在一定程度上得以解决。 或自体移植的基础上输入一定量的供者来源 的白血病细胞特异性的 CTL 细胞,增加 GVLE,在某种程度上可能会改变自体 移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneic stern cell transplantion, Allo-S CT),由于存在 GVLE,使得一些患者能够得以长期生存,然而伴随而来的移植 物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD),严重感染,植入失败,造血重建 延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL 细胞是 GVHD 及 GVLE 的效 应细胞,也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴 细胞输注(Donor lymphocyte transfusions, DLT)能诱导出 GVLE 消除白血病复发, CTL 细胞是它的主要效应细胞。DLI 在受者体内也会产生多种移植相关并发症, 如何得到最佳疗效,使 DLI 得到更好的应用,是现在临床面临的一大课题。

ALL 细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1),ALL 对 NK 的治疗效果差,C TL 细胞似乎成了除了药物唯一能针对 ALL 肿瘤的效应细胞了。 CTL 细胞在免疫 治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。临床上发现, 植入是否成功以 及 GVHD 的严重程度与移植后供、受体 T 细胞比例显著相关。异基因干细胞移 植即便是完全供者型, 也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞,找出针对 自身肿瘤细胞的受者的 CTL 克隆,发挥 RVLE (Recepient-versus leukemi effect, RVTE),在排斥及 RVLE 之间找到最佳平衡点,不仅能发挥自身识别肿瘤的免 疫清除功能, 而且协同供者成分发挥杀瘤效应, 同时有助于了解代替免疫与过继 免疫的理念, 分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生 存,而一些患者在完全供者嵌合(FDC)状态下出现原疾病复发的原因。Wilms tu mor antigen-1(WT1)过度表达在 70%-90%的 ALL 病人中,而这样的病人有着高 的复发率。体外及小鼠研究中的证实,WT1 是一个有意义且广泛表达的白血病 抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有 WTl 特异性的 T 细胞,说明 WTl 的表达 很容易诱导出 T 细胞反应。WT1 特异性的 CD8+的 T 细胞和白血病肿瘤负荷减 轻密切相关。高度纯化 CD8+T 细胞混合骨髓移植会产生高 GVL 效应低的致死 性 GVHD 已得到证实。如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的 CTL 克隆,对正常细胞无明显作用,无 GVHD,无排斥,宿主完全耐受,扩增 率高并能在体内增殖,具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力,那么分离 G VHD 与 GVL 即将成为可能,改善自体移植效果成为可能,增进过继免疫治疗成 为可能。那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性 CTL 细胞?这就是本实验 的主要研究目标:拟在体外分离培养 CD8+WT1 特异性的 CTL 细胞克隆,并从 多方位鉴定其功能特性及其来源,为进一步的研究及应用打下坚实的基础。 方法: 1.体外 DC 培养树突状细胞(dendritic cell, DC)主要的功能就是特异性抗原 提呈。成熟 DC 加工处理抗原肽-MHC-1 复合物,并提呈给 T 细胞。DC 传统培 养方法大致需要 4-10 天,前几天为诱导分化期,最后一天为诱导成熟期。DC 成 熟所需时间太长,与体外 CTL 培养不能同步。我们改进了 DC 培养为 2 天诱导 成熟法。与传统培养法及 7 天培养法方法比较:(1)利用四色流式细胞技术进行 表型分析。(2)利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。(3)通过 HLA-A*0201 同 型的 Tc 细胞对 WT1/HLA-A*0201 阳性肿瘤细胞 NB4 的杀伤率来评价 DC 的提 呈功能。 2.健康供者 CTL 细胞单个克隆培养 (1)免疫磁珠分选 CD56-CD8+细胞: HLA-A*0201 健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)行免疫磁珠去 CD56+的细胞 (NK)细胞,再行 CD8 阳选,PHA/WTI 肽间段性刺激下行体外扩增。(2)流式细胞 分选:以 CD19-细胞群中设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer 及 CD8 双阳性的细 胞为目的 CTL 细胞,收集。(3)饲养细胞的制备:三人份非 HLA-A*0201 阳性的 健康供者 PBMNC 进行 γ-射线 50Gy 照射, 制备成饲养细胞。 (4)CTL 细胞克隆制 备:所分选的目的细胞行有限稀释法制备单个克隆,按比例与抗原负载的 DC 及 饲养细胞混合后体外扩增培养。(5)CTL 克隆细胞表型鉴定:流式检测 CD45RA/ CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a 分子的表达率。(6)CTL

克隆胞内分子检测:流式检测胞浆毒性颗粒 GranzymeB、Perforin 的阳性率。(7) 分泌功能检测:CBA 法检测 IL-2、IL-4、1L-6、IL-10、TNF-α、IFN-y、IL-17 在 CTL 细胞培养上清的浓度。(8)细胞毒性的检测:克隆细胞对标准瘤株及白血 病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。 3. 白血病 NASCT 患者外周血来源的 C TL 单个克隆培养 (1)体外刺激扩增:加用刺激因子与 WT1 肽进行体外特异性 T c 细胞诱导扩增。(2)扩增后的 Tc 细胞流式分选:CD3+CD19-细胞群设门,WT1 /HLA-A*0201/Pentamer 及 CD8 双阳性的细胞分选后收集(CTL 细胞)。(3)三人份 非 HLA-A*0201 阳性的健康供者外周血单个核细胞进行 Y-射线 50Gy 照射,制 备成饲养细胞。 (4)有限稀释法制备克隆细胞, 按比例混合抗原负载的 DC 及饲养 细胞体外扩增培养。 (5)流式检测克隆表型分子 CD45RA/CD45RO、 CCR7、 CD3、 CD8、CD28、CD27、CD107a 的表达率。(6)CTL 克隆细胞胞浆毒性颗粒 Granzy meB、 Perforin 的阳性率检测。 (7)CBA 法检测克隆细胞分泌的 IL-2、IL-4、IL-6、 IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17 的浓度。(8)克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗 杀伤率的检测来鉴定其功能(CFSE/PI 双标法)。四、白血病 NASCT 患者与健康 供者体外培养 CTL 克隆的比较研究利用上述方法体外平行培养两类不同来源的 CTL 克隆,进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。五、CTL 克隆细胞来 源与功能的镜下研究 (一)性别染色体荧光原位杂交(FISH)区别 CTL 克隆的来源 选用 5 例供受者性别差异的白血病移植后患者体外 CTL 克隆细胞进行性别探针 杂交, 荧光显微镜下观察杂交信号, 根据 x,Y 染色体的不同信号来鉴定克隆来源。 (二)激光共聚焦扫描镜下观察 CTL 克隆的形态与功能选取受者为 HLA-A*0201 阳性、供者非 HLA-A*0201 阳性的白血病 HLA 半相合 NASCT 后患者体外培养 WTl 特异性 CTL 克隆细胞,WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE 标记 CTL 细胞,PK H26 标记 DC,CFSE 标记靶细胞 NB4(WT1 及 HLA-A*0201 双阳性的人急性早 幼粒细胞白血病瘤株),共同孵育 2h,镜下观察形态与功能。 (三)扫描电镜观察 克隆细胞细微结构与功能白血病移植后患者 WT1 阳性的 CTL 克隆细胞体外培养 4-6 周后,收集细胞并依次与 DC 及 NB4 细胞以一定比例混合培养 2h 后,收集 处理细胞,镜下观察克隆细胞的功能。六、白血病 NASCT 患者与健康供者 CT L 克隆蛋白表达差异分别选取三份健康人及白血病患者移植后体外扩增培养 6 周 后的 CTL 克隆细胞,收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双项电泳、染色、扫 锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白,酶切,质谱分析。健康人外周 淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋白差异谱对照, 生 物信息检索分析找出反应蛋白。结果一、体外树突状细胞培养 1、3 种方法培养 的未成熟及成熟 DC 在形态上无差别; 2、 3 种培养法未成熟 DC 表型存生明显差 异: 传统培养法 CD1a,CD86(P0.01),CD83,HLA-DR(P0.05)的表达均明显高于 2 天 法;传统培养法 CD1a(P0.01)的阳性表达率明显高于 7 天法;7 天培养法 CD83, HLA-DR(P0.05)的表达明显高于 2 天法;7d 法的 CD83(P0.05)明显高于传统法; 成熟 DC 表型差异:2 天培养法与 7 天培养法无差异;2 天培养法 CDla,CDllc,C D80,HLA-DR 的表达明显高于传统培养法(P0.05);7 天培养法 CD80,CD83 的表

达明显高于传统培养法(P0.05);3、3 种培养法成熟 DC 的抗原活性:2 天及 7 天 培养法 DC 辅助 Tc 对靶细胞的杀伤率(75.8± 7.1)%,(74.6± 3.2)%明显高于传统法(6 5.2± 1.3)%(P0.01)。二、健康供者 CTL 克隆细胞培养与鉴定 1、表型:CD3+CD8 +的细胞占(98.7± 0.2)%,CD27 占(62.3± 10.0)%,CD28 占(71.9± 7.9)%;CD107a 占(4 9.0± 11.0)%,CD45RA 占(65.1± 8.4)%,CD45RO 占(34.3± ± 4.2)%,CCR7 占(18.1± 5.2)%。 2、胞内毒性颗粒表达率:颗粒酶 B:(43.9± 7.4)%,穿孔素:(32.7± 6.8)%。3、CT L 克隆亚群比例:CD45RA+CD27+CCR7+细胞群占(9.0± 2.0)%;CD45RA-CD45 RO+CD27+CCR7+的细胞群占(13.0± 2.4)%;CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7细胞群占(26.1± ± 5.9)%;CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(61.3± 7.9)%。4、五聚体检 测:WT1/HLA-A*0201 五聚体及 CD8 双阳性率在(76± 3.9)%。5、分泌功能(pg/ ml):IL-2 浓度为(2129.5± ± 414.7)、IL-4(17.5± 9.1)、IL-6(21.6± 9.7)、IL-10(24.8± 8. 6)、TNF-α(40.8±21.5)、IFN-γ(102.3±61.0)、IL-17(18.5± 8.6)。6、对 NB4 的杀伤 率(89.7± 7.6)%明显高于对 U937 和 K562 杀伤率(19.0± 4.3)%,(19.7± 5.2)%,P0.05。 对白血病原始瘤苗 AML 和 ALL 的杀伤率(54.0± 16.6)%,(56.5± 12.4)%,无差别 P0. 05。三、白血病 NASCT 患者 CTL 克隆细胞的培养与鉴定 1、表型:CD3+CD8 +的细胞占(98.6± 0.5)%,CD27 占(66.3± 8.1)%,CD28 占(70.1± 7.8)%;CD107a 占(51. 4± 7.7)%,CD45RA 占(65.7± 6.3)%,CD45RO 占(33.9.1± 4.5)%,CCR7(17.1± 2.7)%。 2、 胞内毒性颗粒表达率:颗粒酶 B:(40.6± 9)%,穿孔素(30.9± 6.2)%。3、克隆亚群比 例:CD45RA+CD27+CCR7+占(12.6± 3.2)%CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占(1 7± 4.6)%;CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(19.5± 3.6)%;CD45RA+CD27+/CD28+/-占(62.1± 7.4)%。4、五聚体检测:WT1/HLA-A*0201 五聚体及 CD8 双阳 性率在(70.2± 8.5)%。5、分泌功能:IL-2(2365.0± 246.1)%、IL-4(40.5± 8.3)%、IL6(1705.3.6± 416.2)%、IL-10(63.2± 22.2)、TNF-α(121.3±35.3)%、IFN-γ(219.5.3±65. 1)%、IL-17(14.5± 5.0)%。6、对 NB4 的杀伤率(84.5± 5.1)%明显高于对 U937 和 K 562 杀伤率(21.5± 5.5)%,(22.3± 6.5)%,P0.05。 对白血病原始瘤苗 AML 和的杀伤率(6 6.4± 7.6)%明显高于对 ALL 的杀伤率(58.6± 5.6)%,P0.05。 四、 白血病 NASCT 患者 与健康供者 CTL 克隆比较两者表型无差异:毒性颗粒表达率无差异;患者分泌 的细胞因子 IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ 明显高于健康供者(P0.01),IL-17 无差别(P0.05);细胞毒功能未发现明显差别。五、白血病 NASCT 患者 CTL 克 隆来源与功能研究 1、FISH 发现了白血病 NASCT 患者体外培养 CTL 克隆中有 受体的 CTL 细胞;2、LMST 发现白血病 NASCT 后受者的 CTL 细胞并直接观察 到其细胞毒性。2、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的 CTL 克隆细胞呈典型 T 细胞形态,与 DC 细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功能。六、两类 单克隆 CTL 细胞蛋白表达差异 1、 NASCT 患者与健康供者外周血未培养的淋巴 细胞蛋白差异点有 30 个,鉴定出 13 个功能明确的蛋白。2、白血病 NASCT 患者 与健康供者 CTL 克隆细胞差异蛋白点 44 个,鉴定出 25 个功能蛋白,明显上调的 1 8 个,下调的 12 个,4 个为未命名蛋白。3、白血病及移植相关的共同反应蛋白有 4 个,分别为 Coactosin-like protein、Septin-1]、 Purine nucleoside phosphorylase,

GATA3。结论(1)2 天诱导成熟的 DC 形态功能都达到功能 DC 的标准,这种培养 方法是成功的。(2)健康人与白血病患者体外 CTL 单个克隆培养方法是成功的、 在体外能有效扩增(单个细胞扩增到 1-5× 107 个细胞),扩增成功率为 78%。经一 系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性 CTL 细胞。(3)培养的 CTL 克 隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型, 说明克隆细胞是由一个细胞分化增殖 形成不同阶段的细胞亚群组成。(4)白血病 NASCT 患者来源的 CTL 克隆分泌功 能明显比健康供者的 CTL 克隆旺盛。(5)免疫磁珠分选结合五聚体流式分选可以 得到高纯度的 CD8+的 CTL 细胞,可以做为单个克隆培养的备用细胞。(6)HLA 限制性肽特异性的五聚体与 FISH 相互补充,可以鉴定一部分 NASCT 患者 CTL 克隆的来源。(7)健康供者与白血病 NASCT 患者之间的 PBMNC 及 CTL 克隆在 蛋白表达上存生着明显差异。

CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写,中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细 胞”。 CIK 是单个核细胞在 CD3 单抗和多种细胞因子(包括 IFN-γ、IL-2 等)的作用 下培养获得的一群以 CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群,其既具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性,又具有 NK 细胞(自然杀伤细胞)的非 MHC(主要组织 相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK 细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广,对正常 组织毒性低,体外可高度扩增等特点,是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细 胞。 DC 是“DendriticCells”的缩写,中文全称为“树突状细胞”,因其成熟时伸出许多树 突样或伪足样突起而得名。 DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家 RalphM. Steinman 于 1973 年发现的,是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells,APC)。 已证实, DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞(Na?ve T cells)增殖的 APC,而其它 APC(如单核巨噬细胞、B 细胞等)仅能刺激已活化的或 记忆性的 T 细胞。DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者,在肿瘤免疫中具有 极其重要的作用。 DC-CIK 即 DC 和 CIK 细胞在体外共培养,然后回输给患者。严格的说,最终的效 应细胞是经 DC 体外活化的 CIK 细胞。多项研究表明,DC 与 CIK 具有协同作用, 共同孵育后,DC 表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高,而 CIK 的增 殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强,因此 DC-CIK 较单独的 CIK 治疗更为有 效。若将肿瘤抗原负载的 DC 与 CIK 共培养,可刺激产生肿瘤抗原特异性的 T 细 胞,这样的 DC-CIK 治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用,比未负载肿 瘤抗原的 DC 刺激活化的 CIK 活性更强,常被用于临床和科研。

1.DC 培养用细胞因子: GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子): GM-CSF 是一种造血生长因子,在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成, 并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的?功能。GM-CSF 是最早 被鉴定出来对于 DC 有作用的细胞因子之一。 GM-CSF 在 DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化, 细胞表面 MHC II 类分子的表达得以提高,从而增强细胞的抗原递呈功能。此外,GM-CSF 还可促 进 DC 的存活。 IL-4(白细胞介素-4) IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长, 从 而引导单核细胞向 DC 方向分化。若培养体系中不加 IL-4,单核细胞将分化为巨噬 细胞。同时,IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降 低是单核细胞分化为 DC 的重要标志。 GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟 DC(immature DC), 此时 的 DC 具有较强的抗原摄取和加工能力,但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达 MHC I 类、II 类分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等),但不?表达 CD14。 TNF-α(肿瘤坏死因子-α) TNF-α 可下调未成熟 DC 的巨胞饮作用和表面 Fc 受体的表达,使细胞内 MHC II 类分子区室(class IIcompartment)消失,但能够上调细胞表面?MHCI 类、II 类分子和 B7 家族分子(CD80、CD86 等)的表达,使未成熟 DC 分化为成熟 DC(matureDC), 此时 DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱,而抗原递呈能力显著增强,可极强的激 活 T 细胞。 2.CIK 培养用细胞因子和抗体: CD3 激发型单抗:) T 细胞活化的第一信号来自于 T 细胞表面的受体, 即 T 细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与 APC 提呈的抗原的特异性结合,也就是 T 细胞对抗原的特异性识

别。TCR 是由 2 条不同肽链构成的异二聚体,在 T 细胞表面,其与 CD3 分子通过 非共价键结合,形成 TCR/CD3 复合体。TCR 识别特异性抗原后会引起 CD3 和 T 细胞表面的?辅助受体 CD4 或 CD8 分子的胞浆尾部聚集,进而激活与胞浆尾部相 连的酪氨酸激酶(Lck、Fyn 和 ZAP-70 等),促使 CD3 分子胞浆区的免疫受体酪氨 酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸 化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白,从而引起激酶活化的 级联反应(磷脂肌醇途径 MAP 激酶途径等),最终通过激活转录因子,使其进入细 胞核内,结合于调控 T 细胞增殖和活化的靶基因(?如 IL-2 和 IFN-γ 等),引起基因 的表达和转录,T 细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。 由上可见,CD3 分子在 T 细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3 激发 型单抗与 T 细胞表面 CD3 分子特异性结合后, 可引起 CD3 分子胞浆区 ITAM 基序 中酪氨酸的磷酸化,进而导致 T 细胞增殖和活化的下游信号的激活,从而使 T 细 胞增殖和活化。也就是说,CD3 激发型单抗能够模拟抗原与 TCR/CD3 复合物的识 别和激活过程,从而引起 T 细胞的增殖与活化,因此是 CIK 细胞培养中不可或缺 的刺激因素。 此外, CD3 激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。 研究表明, 仅克隆号为 OKT-3 的 CD3 激发型单抗可以刺激所有人的 T 细胞的增殖, 而其它克隆号的 CD3 激发型 单抗仅能刺激一部分人的 T 细胞。因此,在进行 CIK 培养时,最好选用 OKT-3 克 隆,以保证每个患者的 T 细胞均能被激活。 IL-2(白细胞介素-2) IL-2 最初发现时被称为 T 细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF), 是引起 T 细胞 增殖最重要的细胞因子。IL-2 既是自分泌细胞因子,也是旁分泌细胞因子,其通过 与 T 细胞表面的 IL-2 受体(IL-2R)的特异性结合而促使 T 细胞活化,并进入细胞分 裂状态。此外,IL-2 还可刺激 NK 细胞的生长并增强其杀伤能力。因此 CIK 细胞 培养中须添加 IL-2,以促进 T 细胞的增殖与活化。 IFN-γ(干扰素-γ) IFN-γ 具有上调外周血淋巴细胞表面 IL-2R 表达的作用,因此会增强 T 细胞对 IL-2 促增殖反应的敏感度和强度。 在诱导 CIK 细胞形成的过程中加入 IFN-γ, 可降低 IL-2 的用量。 研究发现, IFN-γ 加入的顺序与 CIK 的细胞毒活性密切相关。 先加入 IFN-γ,

培养 24 后再加入 IL-2,可明显提高 CIK 的细胞毒活性。 IL-1a(白细胞介素-1a) IL-1a 也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达 IL-2R。当 IL-1a 与 IFN-γ 和激发型 CD3 单抗合用时,可以明显提高 CIK 的细胞毒作用。

1.外周血单个核细胞的采集 1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100ml; 1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC); 获得纯度在 90%以上的 PBMC, 细胞数量需达到 1-3 x 1.3 无血清培养液洗涤 2 次, 108。 2.(可选步骤)肿瘤抗原的制备] 用于负载 DC 的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA) 或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA),也可以是肿瘤全细胞抗原。 用 TSA 或 TAA 负载的 DC 具有很好可克服这些缺陷, 因为此时无需知道那些抗原 是肿瘤细胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击 DC 可诱导产 生针对不同抗原决定簇的细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)克隆,从而实现对肿瘤细胞的有 效杀伤。 肿瘤细胞全抗原负载 DC 的方法很多,包括用肿瘤细胞裂解液负载 DC、用凋亡肿 瘤细胞负载 DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载 DC,用肿瘤活细胞负载 DC,和将 肿瘤细胞与 DC 融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载 DC,因该方 法简单、快速、有效。 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法,具体步骤如下: 2.1 手术切除肿瘤标本,无菌条件下,将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净; 2.2 无菌生理盐水洗 3 次; 2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎,加入 RPMI 1640 培养基,充分研磨; 2.4 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液; 2.5 用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x 107/ml,装入 5ml 无菌冻存管中; 再迅速放入 37℃水浴中解冻 10 min。 2.6 将冻存管浸入液氮中速冻, 10 min 后取出, 反复 3-5 次; 注:也可以-80℃/37℃反复冻融 3-5 次。 2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中,3000rpm,离心 10min; 2.8 收取上清,0.22μm 滤膜过滤除菌,留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体; 2.9 -80℃保存备用。 3.0 CIK 细胞的培养及鉴定 置于培养 3.1 步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x 106/ml, 瓶内; 3.2 37℃,5%CO2 培养箱中孵育 2h,以使单核细胞贴壁; 3.3 收集悬浮细胞,用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 106/ml; 3.4 加入 1,000 U/ml 的重组人 IFN-γ 培养; 3.5 24h 后加入 50ng/ml 的 CD3 单克隆抗体和 300 U/ml 的重组人 IL-2,刺激 CIK 细胞的生长和增殖; 注:此时也可同时加入 100U/ml 的重组人 IL-1a。 3.6 每 3 天半量换液或扩瓶一次,并补加重组人 IL-2300 U/ml; 3.7 在培养的第 7d,收获 CIK 细胞,此时数量应达到 1x109 个以上; 3.8 CIK 细胞质控: 3.8 .1 台盼蓝染色检测细胞活力:活细胞应在 80%以上;

培养细胞活力的检测台盼蓝排斥实验 1.制备单个细胞悬液,适当稀释; 2.向细胞悬液中加入 0.4% 台盼蓝溶液,使台盼蓝终浓度为 0.04% ; 3.在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞,死细胞被染成淡蓝 色。 注意事项:在三分钟内完成死细胞计数,否则部分活细胞也会被染色,影响实验 的准确性。 3.8 .2 用流式细胞仪检测细胞表面 CD3、CD8 和 CD56 等分子的表达,观察 CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。 4.DC 细胞的培养及鉴定 4.1 步骤 3.2 中剩下的贴壁细胞(主要是 CD14+的单核细胞), 加入含重组人 GM-CSF 500-1,000U/ml 和重组人 IL-4 500U/ml 的无血清培养液,37℃,5%CO2 培养箱中培 养,诱导单核细胞向 DC 细胞分化; 4.2 每 3d 半量换液一次,并补足细胞因子; 4.3 (可选步骤)?在培养的第 5d, 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 mg/ml,对 DC 进 行抗原负载; 注:若不对 DC 进行抗原负载,该步省略。 4.4 在培养的第 6d,加入重组人 TNF-α(500U/ml),诱导 DC 细胞成熟; 4.5 在培养的第 7d 或第 8d,收获 DC 细胞,其数量应达到 1× 106 个以上; 4.6 DC 的质检: 4.6 .1 台盼蓝染色检测细胞活力:活细胞应在 80%以上; 4.6 .2 流式细胞仪检测 DC 细胞表面 HLA-DR、CD83 和 CD86 等分子的表达以确 定 DC 是否成熟。 5.0 DC-CIK 细胞的制备和质检 5.1 收集步骤 4 和步骤 3 中所获得的 DC 细胞和 CIK 细胞, 按 1:10(数目比)的比例 共培养,无血清培养液中添加重组人 IL-2 (300 U/ml); 5.2 每 3 天半量换液一次,并补加重组人 IL-2 (300U/ml)。 5.3 在第 7d 收集细胞,细胞数量应达到 1× 1010 个以上; 5.4 DC-CIK 细胞的质检: 5.4 .1 台盼蓝染色检测:活细胞应在 80%以上;

5.4 .2 流式细胞仪检测细胞表面 CD3、CD8、CD56 等分子的表达:CD3+CD56+细 胞的比例应在 20%以上。 5.4 .3 细胞杀伤实验:以 DC-CIK 细胞为效应细胞,以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞 或肿瘤细胞株)为靶细胞,将效应细胞与靶细胞按 10:1(数目比)的比例加入 96 孔 U 型板中,每孔含靶细胞 1 x 104 个,终体积为 200ml,设 3 个复孔。培养 4h,然后 取培养上清,用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。 5.4 .4 收获细胞前,取少量培养物进行细菌、真菌培养,并检测支原体、衣原体, 及内毒素(标准:病原学检测阴性,内毒素<5 Eu)。

注:AF 即 Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动

质,尤其是牛蛋白的混入,使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病

牛病,克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应,因此细胞治疗的体外细胞 中最好使用无动物成分的重组细胞因子。


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