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丛枝菌根研究方法


丛枝菌根研究方法
1.检测孢子含量的方法(湿筛倾注蔗糖离心法)
1.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244 2.刘润进,李晓林.2000.丛枝菌根及其应用.北京:科学出版社:190-194 根据上述方法略有改动 1. 称取 10 g 菌剂,置入大烧杯中加 500 ml 水,搅拌,静置 10 s。 2. 先后过 80 目分样筛、400 目分样筛,将 400 目筛子上的残余物用药匙转入 50ml 离 心管中,后用清水冲洗筛子,将残余物全部转入离心管中,配平,3000 转/min 离 心 10 min。 (注分样筛最好直径为 12 cm 左右,便于下面放置烧杯过筛) 3. 去掉上清液,在离心管中加入预先配制好的质量分数为 50%的蔗糖溶液,玻璃棒搅 匀,配平,3000 转/min 离心 10 min(注意离心前离心管壁上不能有残余物) 。 4. 将 400 目筛子呈一斜面放置,离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧,用水将筛子上的残 留物轻轻洗入划线培养皿中。 (注意水不能加太多以防影响检测,培养皿划线便于 统计) 。 5. 解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目,计算出菌剂中的孢子含量。 注:溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。

2.检测菌根侵染率的方法(曲利苯蓝染色法)
Phillips J M,Hayman D S,1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158~161 根据上述方法略有改动 1.将洗净的幼苗根系剪成 1 cm 左右的根段,用 FAA 固定液(70%酒精:甲醛:冰醋酸 =90:5:5)固定 24 h。 2.加入 10% KOH 在 100℃的恒温干燥箱内反应 45 min(去除细胞质,便于染色。一般来 说,幼根需要时间较短,大约只要 0.5 h,老根需要时间长,大约 1 h,以根系相对透明 为标准)。 3.洗去碱液, 加入 10% H2O2 漂白 15 min, 用蒸馏水清洗, 加入 0.2 mol· -1 盐酸酸化 1h L 以上(可以延长,曲利苯蓝为酸性染料,需酸化,酸化时间应不少于 30 min)。 4.曲利苯蓝(Trypan blue)乳酸酚溶液(乳酸 100 mL,甘油 100mL,苯酚 100 mL,蒸馏水 100 mL,曲利苯蓝 0.2 g)染色 5 min。 5.乳酸酚(乳酸 100 ml,甘油 100 mL,苯酚 100 mL,蒸馏水 100 mL)脱色 15min。 6.制片,镜检。 7.试验中可用自来水代替蒸馏水,苯酚有毒,进行染色、脱色步骤时需在通风橱中进行, 实验人员需戴口罩。 说明: 常规制片用水即可, 用封固剂 (聚乙烯醇 1.66g, 甘油 1 ml, 乳酸 20ml , 蒸馏水 10ml) 制片片子可以保存较长时间,但容易产生气泡,另聚乙烯醇有毒需小心。 经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。

3.统计方法
?

Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221.

Estimation of AMF colonisation
Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al 丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot 等,1986) a. Mount 15 root fragments on one slide; prepare two slides (30 root fragments total).

1.将 15 个根段固定在 1 张载玻片上,30 个染色后的植物须根根段制 2 个片子。 b. Observe these fragments under the microscope and rate according to the range of classes indicated in figure 1. These classes give a rapid estimation of the level of mycorrhizal colonisation of each root fragment and the abundance of arbuscules. 2.在显微镜下观察这些根段,按照图 1 的分类方法确定分级,这种分级包括对每 个根段菌根侵染率水平和丛枝丰度的快速评估。 c. Put the values into the computer program 'Mycocalc' to calculate the parameters: %F, %M, %m, %a and %A, according to Trouvelot et al.. 1986. (see Figure 1 from Trouvelot et al 1986)

3.将观测值代入计算机软件“Mycocale”中即可按照以下相关公式计算出相关 的菌根侵染度参数:%F,%M,%m, %a 和%A

o

Frequency of mycorrhiza in the root system 根系中的菌根侵染率(%F)=有菌根根段数/总根段数*100

o o

F% = ( nb of fragments myco/total nb)*100 Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root system 根系中的菌根侵染强度(%M)=( 95*侵染率 90%以上根段数+70* 侵染率 50%至 90%的根段数+30*侵染率 10%至 50%的根段数+ 5* 侵染率 10%以下 1%以上根段数+ 侵染率 1%以下根段数)/总根段 数*100

o

M% = (95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/(nb total) where n5 = number of fragments rated 5; n4 = number of fragments 4 etc.

o

Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root fragments 相对菌根强度即根段中的菌根侵染强度(%m)=M*总根段数)/有菌 根根段数

o o

m% = M*(nb total)/(nb myco) Arbuscule abundance in mycorrhizal parts of root fragments a% = (100mA3+50mA2+10mA1)/100 (相对丛枝率)菌根根段丛枝率(%a)=( 100*mA3+50mA2 +

10mA1)/100,其中 mA3,mA2,mA1 分别是 A3,A2,A1 所对应的 菌根侵染强度
o

where mA3, mA2, mA1 are the % of m, rated A3, A2, A1, respectively, with mA3=((95n5A3+70n4A3+30n3A3+5n2A3+n1A3)/nb myco)*100/m and the same for A2 and A1.

o

Arbuscule abundance in the root system (绝对丛枝率)根系丛枝率(A%) = a*(M/100)

Figure 1
注:现在找不到“Mycocale”这个软件了,我一般都是显微镜检测后自己计算

结果。统计菌根侵染率的方法有很多,有网格交叉法、频率标准法等,可以搜一 下相关文献。另附《丛枝菌根及其应用》 (刘润进,李晓林主编,2000,科学出版社)的
190-199 页。

4.菌根参考书
期刊:Mycorrhiza 1.J.R.Norris,D.J.Read,A.K.VARMA.1992.Techniques for mycorrhizal research 2.国内有《菌根学》 刘润进、陈应龙主编 《丛枝菌根及其应用》 刘润进、李晓林主编 《丛枝菌根生理生态学》 宋福强主编 《AM 培养新技术及其对土地复垦生态效应》 毕银丽主编 《园艺植物丛枝菌根研究与应用》 吴强盛主编


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