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康复新体外诱导胃癌BGC



昆明医学院学报

2006,

( 2): 5~ 9

CN 53- 1049 /R

Journal of K un ing M ed ica l College m


康复新体外诱导胃癌 BGC- 823细胞凋亡的实验研究
蒋永新 , 王熙才 , 金从国

, 袁
1) 1) 1)



方 , 刘光明 , 李树楠

2)

3)

3)

( 1) 云南省肿瘤医院肿瘤研究所, 昆明 650118 2) 昆明医学院生化教研室, ; 昆明 650031 3) 大理学院药学院, 大理 671000) ;
[ 摘要 ] 目的 探 讨 康复 新 体外 诱导 胃 癌 BGC - 823 细胞 凋亡 及 其机 制 方法 采用 四 甲基 偶氮 唑 盐 结果 不同浓 度 0 57 ) 和

( MTT ) 法测定不同浓度和时间康复新对 BGC - 823细胞的生长抑制作用; 应用流式细胞术进行 DNA 倍体分 析 和 TUNEL 分析, 检测康复新对 BGC - 823细胞增殖和细胞周期 的影响以及 早期凋亡 的情况 康复新对胃癌 BGC - 823 细 胞分 别 作 用 24 48、 72 h 其 I 50 分别 为 ( 17 85 、 C 1 06 )、 ( 13 76

( 11 32 0 14) m g /mL ( P < 0 01), 对胃癌 BGC - 823细胞的抑制作用 呈时间和 浓度依赖关 系; 流式细胞 术 显示胃癌 BGC - 823细胞出现明显的凋亡峰, 随着作用时间的延长, 其凋亡率逐渐升 高, 细胞周 期阻滞在 G2 / M 期, S期细胞数大量减少 ; 流式细 胞术 TUN EL 检测结果显示, 其 作用细胞 凋亡和坏死 同时存在 复新具有诱导胃癌 BGC- 823细胞凋亡的作用 [ 关键词 ] 康复新; BGC- 823细胞 系; 凋亡 ; 机制 [ 文献编号 ] 1003- 4706 ( 2006) 02- 0005- 05 [ 中图分类号 ] R735 2 R 282 74 [文献标识码 ] A ; 结论 康

An Experi ental Study of Traditional ChineseM edicine K angfuxin m Inducing Apoptosis In V itro of Peptic Carcinom a C ell L ine BGC- 823
JI NG Yong- x in , WANG X i- cai , JI Cong- guo , YUAN F ang , L I Guang- m ing , L I Shu- nan A N U ( 1) Yunnan P rovincial Tum or H osp ital K unm ing 650118 2) D ep t of B iochem istry, K unm ing M edical , ; C ollege, K unm ing 650031; 3) Institute of P har acology, Dali College, D ali 671000, China ) m [ Ab stract] Ob jective Invest ig ate the apoptosis - inducing activity of Ch in ese m edic in e Kangfux in Cell prolifera
1) 1) 1) 2) 3) 1)

( KFX ) on hum an peptic carc inom a cell lin e BGC - 823 and its related m echan is . M e thods m

t io n in d ifferent concentration and ti e w as deter ined by MTT ( M ethy th iazo ly l tetrazo lium ) assay T he flu ores m m cence flow cytom etry ( FCM ) DNA assay and TUNEL ( T er in al deoxynux leotide l transferase m ed ia ted ur id in e m nuc leot id e end labeling) w ere applied to detectin g the changes o f apoptot ic rate at the early and the la te apoptosis process, ce ll proliferation and a lterat io n of cell cycle phase Resu lts A fter in cubat io n of BGC- 823 cells w ith different concentratio n of K ang fux in for 24 48 and 72 hours the IC50 w ere ( 17 85 1 06), , , ( 13 76 0 57) and ( 11 32 0 14) m g /mL ( P < 0 01) Kang fux in sign ificantly inh ib ited the pro liferation o f BGC 823 ce ll and the inhibited effect w as dose- and- t i e- dependent FCM assay ind icated tha t m ost of the cells m w ere arrested in G 2 - M and the apoptot ic peak appeared Durin g the pro lo nged in cubation ti e m, rate w as in creased A t the sa e ti e m m , th ere are apoptosis and necrosis Conclusion Kangfux in can in duce BGC - 823 apoptosis in v itro
[基金项目 ] 国家自然科学基金项目 ( 30560181); 昆明医学院三项基金资助项目 ( kylc200529) [作者简介 ] 蒋永新 ( 1968~ ), 女, 云南昆明市人, 医学硕士, 副主任检验师, 主要从事抗癌中药研究

the apoptosis

th e nu ber of S phase ce lls decreased T he result o f TUNEL in dicates that m

6

昆明医学院学报

第 27卷

[ Key w ord s] K ang fux in BGC - 823 cell lin e Apoptosis M echanism ; ; ; 康 复 新 ( kang fu x in KFX ) 是 从 美 洲 大 蠊 , ( 蟑螂 ) 提取物中精制出的 活性成份 最近经体 外 MTT 实验发现, 康复新对个旧肺腺癌 ( GLC )、 个旧肺鳞癌 ( YTMLC )、低分 化胃腺癌 ( BGC 823) 、非小细 胞 肺癌 ( A549 ) 、卵 巢癌 ( TYK )、 胃癌 ( SGC - 7901) 、乳腺癌 ( MCF - 7) 等肿瘤 细胞株都有较强的杀伤能力 鉴于上述结果, 为 了进一步从细胞分子水平研究康复新的抗癌效应 及其作用机制, 我们选用 BGC - 823肿瘤细胞系, 对康复新诱导胃癌 BGC - 823 细胞的凋亡的机制 进行深入细致的研究 用: 取对数生长期的肿瘤细胞株以 1 ! 10 /mL 密
5

度接种于 96孔板上, 培养 24 h并进行分组: 每组 设 3个平行孔, 其中空白对照组: 只加培养基; 实 验对照组: 为培养细胞, 不加药; 实验组: 不同浓 度的 药 物, 康 复新 终 浓 度 梯 度 为: 33 3 27 3 、 、 20 15 10 7 5 5 2 5 1 25 0 625 m g /mL 、 、 、 、 、 、 、 作用 48 h后每孔加入 5 mg /mL 的 MTT 20 L, 继 续培养 4 h 各孔加入 20 SDS~ 50 DM F裂解液 ; % % 溶解甲, 震荡后过夜; 酶标仪以 580 n 为测定波 m 长、 655 nm 为参考波长测定其 OD值 ( A 值 ) , 并 按如下公式计算细胞增殖抑制率:
细胞增殖抑制率 = 1- (实验组 A 值 - 空白对照组 A 值 ) , (实验对照组 A 值 - 空白对照组 A 值 )

1 材料和方法
1 1 材料 1 1 1 试剂 RPM I1640培 养基

用 SPSS软件求出半数抑制浓度 ( IC50 ) 美国 GIBCO 公 1 2 2 测康复新对 BGC - 823 细胞的抑制率 同 样用 MTT 比色法检测康复新对 BGC - 823细胞分 别 作用 24 48 72 h 的细胞 增殖 抑制 率和 IC50 、 、 值 1 2 3 流式细胞仪检测细胞周期的改变 分别收 集 20 m g /mL 的康复新及 50 g /m L顺铂 DDP 作用 细 胞 24、 48 72 h, 用 70 的冷 乙醇 固定 过夜 、 % ( 4 ? ), 加入 RNase ( 1m g /mL ) , 37 ? 处理 1 h , 用碘 化 丙 啶 P I 对 样 本 DNA 荧 光 染 色, 应 用 BECKMAN - COULTER 流式细 胞仪上机检测: 每 个样品收集 1 ! 10 个细胞, 然后用 COULT W I N
4

司; 新 生 小 牛血 清: 美 国 COSTAR 公司; 顺 铂 ( DDP ): 山东省德州制药厂; 噻唑蓝 ( MTT ) : 美 国 AMRESCO公司; 十二烷基硫酸钠 ( SDS )、二 甲基甲 酰胺 ( DM F ) 、乙二 胺四 乙酸 二钠 ( ED TA ) 均为上海生工生物工程有限公司产品; 康复 新: 由大理医学院李树楠教授惠赠; 流式 DNA 和 TUNNEL 试剂盒为美国 BACKMAN COULTER公司 产品 1 1 2 细胞株 低分化胃腺癌 BGC - 823 细胞、 个旧肺腺癌 GLC细胞、卵巢癌 TYK 细胞、宫颈癌 H eL a细胞、胎肺 KM B17细 胞均由本研究室传代 培养 1 1 3 细胞培养 KM B17细胞含 10 的用含新 % 生牛血清、 100 U /mL 青霉素、 100 g /mL 链霉素 的 M EM 常规培养; 其余用含新生牛血清、 100 U / mL 青霉素、 100 培养 1 1 4 主 要仪器 For a 3164型 二氧化碳 培养 m 箱; Ro r a 1205型生物安全柜; M illipore X8200型 m 培养基过滤器; 贝克蔓公司 EP ICS XL, 4C IR 型 流式细胞仪; 徕 卡 DM IRB 型倒置显 微镜; B io Rad 550型酶标仪 1 2 方法 1 2 1 MTT 比色 法 检测康 复新对 BGC - 823 、 GLC、 TYK、H eL a KMB17 细胞株的增殖抑制作 、 g /mL 链霉素的 PRM I1640常规

CYCLE 软件做 DNA 分析 1 2 4 流式细胞仪 TUNEL 法 检测早期细胞凋 亡, 分别收集 20 m g /mL 的康复新及 50 g /mL 顺 铂作用细胞 48 h的 BGC - 823细胞, 调整细胞数 为 1~ 2 ! 10 , 按照试剂盒说明书作标记后上机检
6

测, 采集后用 W in cycle DNA 分析软件分析 FL3单 门中的周期, 得出 G0 /G 1 期、 G2 /M 期、 S期及 P I 等细胞生长特点 1 2 5 统计学处理 数据采用 SPSS10 fo rw indow s 统计软件包处 理, 取 ( x s) 进行 方差分 析和 LSD检验, 以 P < 0 05为显著性界限; 趋势图用 EXCEL 制作

2 结果
2 1 MTT 法 检 测 康 复 新 对 BGC - 823 GLC、 、

第 2期

蒋永 新, 等

康复新体外诱导胃 癌 BGC - 823细胞凋亡的实验研究

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TYK、H eL a肿瘤细 胞系及正常细 胞 KMB17 的杀 伤率 不同浓 度康 复新 作用正 常 细胞 ( 胎 肺细 胞 KM B17) 48 h 经 M TT 法检测, 无明显的杀伤抑 , 制作用; 而不同浓度康复新对 BGC - 823 GLC、 、 TYK、H eLa肿瘤细胞作用 48 h显示了一定的抑制

作 用, ( 15 74

I 50 分 别 为 ( 13 99 C 0 41) m g /mL、 ( 11 56

3 22 ) mg /mL、 1 02) m g /mL

和 ( 17 87

0 68) m g /mL, 并对细胞的生长抑制

作用呈浓度依赖关系, 结果见图 1

图 1 不同 浓度康复新作用不同肿瘤细胞株 48 h的生长抑制作用 F ig 1 The grow th- inhibition rate o f diffe rent concentration K angfux in in 48 hours aga inst different cancer ce lls

2 2 MTT 法检测康复新对 BGC - 823肿瘤细胞不 同时间的抑制率 不同浓度康复新对 BGC - 823细胞分别作用 24 、 48 72 h显示, 康复新对 BGC- 823细胞的生长抑制 、 作用呈时间和浓度依赖关系, 随着药物浓度的不断

增大、作用时间的不断延长, 其杀伤率也逐渐增加. I 50分别 为 ( 17 85 1 06) mg /mL、 ( 13 76 C ( P < 0 01) 结果见图 2 0 57) m g /mL 和 ( 11 32 0 14) mg /mL, 均有显著性差异

图 2 不同浓 度的康复新对 BGC - 823细胞的生长抑制作用 F ig 2 T he g row th - inh ib ition ra te of different concentration K ang fux in against BG C- 823 ce ll

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昆明医学院学报

第 27卷

2 3 FCM 检测康复新 ( KFX) 作用 BGC - 823细 胞不同时间周期的改变 康复新作用 BGC - 823细胞 24 48 72 h后, 、 、 FC 检测其细胞周期的改变, 结果见表 1 从表 1 M 中可知, 康复新能明显改变 YTMLC 的细胞周期,
表1 时间 ( h) 24 组别 空白组 K FX 组 DDP 组 48 空白组 K FX 组 DDP 组 72 空白组 K FX 组 DDP 组 与空白组相比,
*

随着作用时间的延长, S 期细胞明显减 少, 细胞 生长被滞留在 G2 /M 期, 并随着药物作用时间的 延长, 凋亡率逐渐增加

FCM 分析康复新对 BG C- 823细胞周期的影响 (% , x G0 /G1 51 43 3 85 39 12 5 51* 53 05 4 72 52 17 12 06 40 37 10 46 63 98 8 73# 45 97 4 49 56 52 5 44* 72 17 4 82
# * #

s) s) 凋亡率 1 52 5 02 3 23 0 83 1 38* 1 75
# #

T ab 1 E ffect o f KFX on ce ll cycle of BGC- 823 ce lls by flo cytom etry (% , x w n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 S期 37 85 10 54 24 83 2 87* 43 28 2 13 32 9 22 63 21 52 5 06 26 07 8 49# 49 53 7 39 26 55 4 24* 22 12 3 62
* # * #

G2 /M 期 10 10 34 92 14 95 43 97 6 95 5 11 11 14 5 77
* #

2 47 1 28

18 87 3 92* 15 63 2 47* 26 18 3 71* 1 71 0 25
#

8 18 4 44# 1 83 1 67 16 25 3 50*
*

30 88 6 35* 36 60 5 11

#

5 75 1 51

* #

P < 0 05, 48 h和 72 h与 24 h相比,

P < 0 05

2 5

FCM TUNEL 法检测 48 h 康复 新对 BGC 823细胞诱导早期凋亡的检测 结果见表 2 FCM TUNEL 法检测康 复新作用

DDP 组其凋亡率和坏死率均比对照组高, 有显著 差异性 ( P < 0 01) ; KFX 组和 DDP 组比较, 凋 亡率无显著性差异 ( P > 0 05) .

BGC - 823 48 h 细胞 早 期凋 亡, 表明 KFX 组 和
表2 FCM TUNEL 法分析 48 h康复新对细胞早期凋亡的影响 (% , x s) s)

T ab 2 E ffect o f KFX on Ea rly A pop to sis of BG C- 823 C ell by FCM TUNEL ( % , x 组别 空白组 KFX 组 DDP 组 作用时间 ( h) 48 48 48 凋 亡率 2 18 0 56 10 48 10 56 1 16 1 11 坏死率 1 68 0 47 14 90 2 17 20 90 1 64

n 6 6 6

3 讨论
近年来, 中药诱导肿瘤细胞凋亡已成为一条 很有希望治疗肿瘤的新途径 中药康复新从美洲 大蠊 ( 蟑螂 ) 提取物中精制出的活性成份, 是用 于治疗金疮、外伤、溃疡、烧伤、烫伤、褥疮疮 面及胃痛出血, 胃、十 二指肠 溃疡的 经典药 物, 我们利用 MTT 法, 以抑制肿瘤细胞增殖活性为指 标, 发现含有从美洲大蠊 ( 蟑螂 ) 提取物中精制 出的活性成份康复新具有一定的抗癌作用, 具有

深入研究的价值 MTT 法发现康复新对多种人癌细胞具有明显的增 殖抑制活性, 不同浓度的康复新对 BGC- 823 、GLC 、 TYK、H eL a肿瘤细胞作用 48 h后, IC50分别为 ( 13 99 3 22) mg /mL 、 ( 15 74 0 41) mg /mL、 ( 11 56 1 02) mg /mL和 ( 17 87 0 68) mg /mL, 并对细胞的 生长抑制作用呈浓度依赖关系, 提示康复新具有 明显的抗瘤作用 当不同浓度康复新对 BGC- 823 细胞分别作用 24 48 72 h显示, 康复新对 BGC 、 、 - 823 细胞的抑 制作用呈 时间和浓 度依赖 关系,

第 2期

蒋永 新, 等

康复新体外诱导胃 癌 BGC - 823细胞凋亡的实验研究

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随着药物浓度的不断增大、作用时间的不断延长, 其杀伤率也逐渐增加 减 小, I 50也随时间的延长而逐渐 C 0 57) mg /mL 和 ( 11 32 24 48 72 h 的 IC50 分 别 为 ( 17 85 、 、

有出现形态学改变时检测出细胞凋亡, 具有灵敏 度高的特点 流式 TUNEL 检测结果还显示: 康复 新具有早期诱导 BGC- 823细胞凋亡的作用, 从表 2中可知, 康复新作用 BGC- 823细胞后, 在细胞 中同时存 在凋亡和坏死, 这与 C saba 等 认为的 细胞坏死和凋亡存在一定联系 因此, 中药康复新有阻滞 细胞周期, 抑制肿 瘤生长, 诱导肿瘤细胞凋亡的作用, 由于细胞凋 亡是一个多阶段、多系统参与的极其复杂的过程, 本 实验 仅探讨 了康复 新在体 外对人 低分化 胃癌 BGC - 823细胞株凋亡的影响 我们将进一步对康 复新的活性成分进行追踪分离、鉴定其结构, 并 系统研究其在动物体内的作用, 为将其开发成为 抗癌新药奠定基础 [ 参考文献 ]
[ 1] HANNUN J A A popto sis and the dilemm a o f cancer che o therapy [ J] m 1853 [ 2] G 0LDW ASSER F, SH I IZU T, M J ACKM AN J e t a l , Co rre la tions betw een S and G2 arrest and the cytotox ic ity o f ca ptothec in in hum an co lon carcinoma cells m [ J] [ 3] C ancer Res, 1996, 56 ( 19) : 4424- 4429 Induction o f p53- de Br J Cance r 1998, , M CDONALD A C, BROW N R topo isom erase I inh ib itors [ J] 78 ( 6): [ 4] [ 5] 745- 51 槲 皮素 抗肿 瘤作 用研 究进 展 [ J] 1996, 18 ( 4): 3- 6 袁静, 肖余 B lood, 1997, 89 ( 6) : 1845[ 5]

1 06) mg /mL、 ( 13 76

0 14) m g /mL, 均有显著性差异 顺铂作为一种广泛用于化疗第一线的抗癌药, 它主要通过细胞周期抑制促使癌细胞凋亡而发挥 抗癌作用
[ 1]

, 用顺铂作为阳性对照药与康复新作

比较的流式检测结果表明: 康复新作用 BGC- 823 细胞 24 ~ 48 h 可使 G2 /M 期细胞聚集, 阻滞了 , M /G1 期的转换, 从而干扰了 BGC- 823细胞在细 胞周期中的进程; 同时, 康复新能使 S期细胞减 少, 可能与 干扰了癌细胞 的 DNA 合成有关 而 72 h后, 随着凋亡细胞的不断增多, G2 - M 期细 胞数目逐渐降低, S期细胞 数目与对照组有无差 异 而 DDP 组, 细胞聚集于 G 0 /G1 期, G 2 /M 期 所以, 若康复新与杀灭该周期性抗肿 数目减少

瘤药物, 如 5- FU 联合使用, 其抑制肿瘤细胞生 长的作用可能会更加显著 康复新作用机制与喜树碱类药物相似, 喜树 碱类药物为细胞周期特异性 药物, 主要作用于 S 期, 并对 G2 - M 期边界有延缓作用, 它能够抑制 DNA 拓扑异构酶 ( Topo I) 将 DNA 断端重新结合 的正常 功 能, 并 进 一 步 造 成 DNA 合 成 ( 即 转 录 ) 、干扰细胞分裂周期 ( 延迟 G2 期 ) , 最终导 致癌细胞死亡
[ 2, 3]

pendent and p53 - independent cellular responses by

从高良姜、侧柏叶、款冬花、

银杏等中提取出的槲皮素 ( Q uercetin ) 也是阻断 细胞的 G1 晚期或使细胞聚积在 G2 /M 期, 通过信 号传导机制使细胞凋亡
[ 4]

国外医学中医中药分册,

CSABA S AM ERE S S , PETER C A poptosis nero , , sis and celluar senescence chaperone o ccupancy as a : po ten tia l sw itch [ J] A g ing Cel, 2003, l 2 39- 45 : ( 2006- 03- 15收稿 )

流式细胞仪的 TUNEL 检测有利于发现早、中 期的 DNA 断裂, 可以在凋亡的早期阶段细胞还没



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