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丛枝菌根实验方案


丛枝菌根实验方案
1. 李晓林(1990)采用三室的试验装置, 利用 30μ m 的尼龙网将根与菌丝分开, 建立了菌丝 际。 该方法为研究菌丝及其菌丝际的生理生化变化提供了一条有用的途径。 但是它仍然 不能排除外界微生物及灌溉施肥等措施造成的影响, 为了进一步研究菌丝的生理生化变 化, 必须建立一种无杂菌的菌丝际环境, 将离体双重培养条件下形成共生体中的根与菌 丝分离开来,使菌丝进入菌丝室,而将根阻止在菌根室中,不让二者混在一起,为深入 研究菌根菌丝的生理生化特性提供新的技术和方法。 2. Glomus intraradices 孢子较小,其直径为 44μ m 一 117μ m,平均 77μ m,呈椭球形或 球形,颜色为淡黄色,其孢子的萌发是从联孢菌丝的断口处重新伸出菌丝(图 4—1 图版 I 一 6),而后再伸长、分枝,形成一个密集分枝的菌丝体。它的萌发不同于 G.margarita 孢子和 S.sinuosa 孢子果的萌发。虽然较前两种孢子和孢子果的芽管数略少,但它仍 具有很强的侵染潜力,可能同其具有很强的分枝能力有关。一旦萌发,菌丝的分枝速度 很快。G.intraradices 菌丝的分枝呈垂直方向。新生成的菌丝较联孢菌丝直径更细,对 根段进行侵染会更容易。 3. 菌根室中共生联合体的建立:将有机玻璃条用玻璃胶黏贴在直径为 9cm 的培养皿底部, 将培养皿分为两室,防止两室的培养基质进行营养交换。将 30μ m 的尼龙网黏贴在有 机玻璃条及培养皿壁,直至培养皿上盖,阻止根的进入(图 4—2)。将转移 RiT—DNA 胡萝卜根与萌发的 G.intraradicesSchenck&Smith 丛枝菌根真菌孢子,共同培养的室称 为菌根室(MC),而将菌丝穿过尼龙网进入的室称为菌丝室(HC)。图 4—2 培养皿中的两 室试验装置将 M 培养基 10mL 倒入菌根室中,用于离体双重培养丛枝菌根真菌与转移 RiT—DNA 胡萝 I-根。在菌丝室中:①倒入 10mL 的琼脂培养基质,其中含有 NO3-N 或 NH4-N(N 的含量与 M 培养基中相同), pH 分别为 6. 或 6. 基质中含有 0. 其 0 5, 6% 溴甲酚紫作为指示剂;②倒入 10mL 不含蔗糖的 M 培养基,pH 为 5.5。在相应的菌根 室中接种 G.intraradices 孢子。截取在 M 培养基上生长的转移 RiT—DNA 胡萝 i-根的 根尖 5cm-7cm 置于菌根室中,将萌发的孢子移入根旁空处,由于 G.intraradices 孢子 直径小,每个培养皿移进 30 个孢子。将培养皿在 27℃±1℃的恒温培养箱中黑暗培养。 4. 菌根室中共生联合体生长状况: intraradices 菌根真菌相似于 G. G. margarita 菌根真菌, 其生成的菌丝在与根相遇时入侵根段,在根细胞内形成丛枝。培养近一个月后,在培养 基质中形成了大量的营养孢子及成熟的孢子(图 4—3)。营养孢子的大小为 4lμ m-62μ m,平均为 49μ m,而成熟孢子的大小范围是 67μ m 一 93μ m,平均大小为 78μ m。
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成熟的孢子颜色较暗,孢子壁较厚。营养孢子中充满油滴,可以为菌丝的生长提供能源 物质。 5. 在观察菌丝生长的过程中, 菌根真菌的菌丝中能观察到原生质的双向流动。 菌丝内原生 质的双向流动有助于进一步探索菌丝对物质运输的作用。 菌丝内原生质的双向流动是菌 根真菌的一种普遍现象, 菌根真菌与宿主共生联合关系的建立也依赖于这种双向流动的 驱动力(Smith,1997)。孢子不仅是作为丛枝菌根真菌养分储存的器官,更是一种稳定 的繁殖体, 它的形态特征目前仍是丛枝菌根真菌分类学的重要依据。 目前孢子收集的方 法主要有湿筛倾析法、柱析法、漂浮法和离心法,但是常用的方法仍是湿筛倾析法和离 心法(李晓林、冯固,2001)。这些方法的共同点都是能够将菌根孢子从生长基质中富积 起来,但是孢子与基质的小颗粒特别是沙粒颜色相近,不易于辨别。 6. 测定丛枝菌根孢子密度方法一:常规的湿筛倾析法(Gerdemann 和 Nieolson,1963):(1) 称取一定重量的土壤样品,放在容器内用水浸泡 20min-30min,尽量使土壤松散。如果 土壤黏性很大, 也可加入各种土壤分散剂。 (2)选用一套洁净的、 孔径为 0. m 一 0. 5μ 034 μ m 的土壤筛,按孔径由大至小的顺序从上到下依次叠放,最底层用一固体物垫着,使 筛面稍微倾斜。(3)用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液,停置几秒钟后,使大的石砾和杂 物沉淀下去,然后将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层的土壤筛上,倾倒时,集中倒 在筛面的一个点上,避免整个筛面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次轻轻冲洗停留在筛 面上的筛出物, 以免在上层粗筛面的剩留物中残留有丛枝菌根真菌孢子, 用洗瓶将停留 在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面。(5)将滤液通过细筛并用水冲洗。 在细筛面上冲洗下来的筛出物中, 除了有许多细的沙砾和杂质外, 就含有丛枝菌根真菌 的不同直径的孢子。(6)将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察并计数。 7. 测定丛枝菌根孢子密度方法二:湿筛倾析染色法(简称染色法)改进的湿筛倾析法,前 4 步骤同方法一。(5)用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的试管内,滴 加曲利苯蓝染色剂,放在 90。C 水浴锅或烘箱中加热半小时,进行染色。(6)将染色后 的滤液通过细筛,并冲洗筛上的滤物,可洗去染色剂,将筛出物放在清洁的培养皿里。 在冲洗下来的筛出物中, 除了有许多细的沙砾和杂质外, 就含有丛枝菌根真菌的不同直 径的孢子。(7)将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察并计数,可观测 到紫色孢子。 8. 两种方法对菌根孢子的形态特性以及测定精度比较: 由于孢子是菌根生态分类的主要依 据。孢子在土壤中主要呈无色透明、白色、淡黄、黄棕、棕色、金黄、红棕和黑色等颜
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色(李晓林、冯固,2001),许多孢子的颜色与基质沙土的颜色相近,在计数时不易被分 辨出来而造成计数误差。 利用两种不同的方法来观测菌根孢子的形态特性, 发现有明显 的区别。常规的湿筛倾析法,在双目实体解剖显微镜下观测到孢子呈棕黄色(图 5—1 图 版 11—1),且孢子颜色与沙粒接近。而利用染色法观测到孢子呈紫色(图 5~2 图版Ⅱ一 2),通过湿筛倾析法筛选出的菌根孢子或多或少带有菌丝,菌丝同时也被染色,与周围 沙粒颜色反差较大,观测孢子形态特性比较明显,孢子的图 5—1 湿筛倾析法观测到孢 子形态(棕黄色)图 5—2 染色法观测到的孢子形态(紫色)识别更是一目了然。 因此菌根孢 子很容易在染色剂作用下着色,呈紫色。在显微镜下观测孢子的数量,效果明显,易于 识别,同时降低了孢子密度测定过程中的人为误差,提高了孢子密度测定的精度,染色 后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易于观测,可以明显地提高计数工作效率。以 宁夏大武口煤矸石山接种菌根处理的沙土样品为例, 本试验条件下以传统的湿筛倾析法 来统计孢子密度,10g 沙土样品孢子数平均为 350 个。而利用染色法来测定相同样品的 孢子数平均为 380 个。每个土壤样品精度上平均提高了 8%,染色法较常规的湿筛倾析 法更易于识别和辨认, 提高了孢子密度测定的精度。 丛枝菌根培养新技术及其对土地复 垦生态效应识别更是一目了然。因此菌根孢子很容易在染色剂作用下着色,呈紫色。在 显微镜下观测孢子的数量,效果明显,易于识别,同时降低了孢子密度测定过程中的人 为误差,提高了孢子密度测定的精度,染色后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易 于观测, 可以明显地提高计数工作效率。 以宁夏大武口煤矸石山接种菌根处理的沙土样 品为例,本试验条件下以传统的湿筛倾析法来统计孢子密度,10g 沙土样品孢子数平均 为 350 个。 而利用染色法来测定相同样品的孢子数平均为 380 个。 每个土壤样品精度上 平均提高了 8%,染色法较常规的湿筛倾析法更易于识别和辨认,提高了孢子密度测定 的精度。 9. 两种方法对孢子密度测定速度的比较: 常规的湿筛倾析法测定孢子密度, 本研究条件下 需要 45min-50min 时间来计数完成一个样品(350 个孢子/10g)。 而利用染色法则需要花 费 25min~30min 时间来计数完成 1 个样品(380 个孢子/10g),测定速度上 1 个样品缩 短了一半时问(25 min-30min),本试验 40 个土样,在测定速度上节约 1000min 一 1200min,即 20h。40 个样品在染色过程中可以一次在水浴锅或烘箱中进行染色 30min, 操作简单可行且染色时多个样品可以一次完成, 耗时少, 染色法与常规的湿筛倾析法相 比,仅多了染色一个环节,因此利用该染色法能够极大地提高孢子密度测定的速度,为 大规模样品的孢子密度监测提供了一种快速的方法, 尤其对于初学菌根技术的人更是一
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种可行的快速测定方法。该方法与常规的湿筛倾析法相比,也存在不足,经过在 90℃ 水浴锅或烘箱里加热 30min 染色后的孢子失去了活力变成了死孢子,孢子不能再发芽 被利用, 因此该方法用于大规模测定孢子密度总量是快速可行的, 但是不能区分样品中 丛枝菌根的种类和活性,因而不适合用于收集活孢子。5.5 小结(1)染色法对于陕速测 定丛枝菌根孢子密度总量是可行的,精度较高,对于大批量样品孢子密度的测定可行。 (2)染色法不足之处是孢子经高温加热和染色,不同种或属孢子不易于识别,活孢子数 量不能够统计准确。因此本方法不适合测定活性孢子密度统计。 10. 接种剂孢子含量的测定:通常采用湿筛—倾注,蔗糖离心法。具体方法是,称取一定重 量或体积的待测菌剂 10-100g 或 10-100m1,放人大烧杯中加 500-1000ml 水,搅拌,静 置 10s 后过双层分样筛(上筛 20 目,下筛 400 目)。反复冲洗待测样品并过筛 3-4 次,收 集 400 目筛子上的残留物于大离心管中, 3000r/min 离心 3min 后去掉上清液, 加人 45% 一 50%的蔗糖,搅匀后迅速放人离心机,1500r/min 离心 1.5min 马上过 400 目筛, 并用水轻轻冲洗筛子上面的残留物, 用生理盐水收集于培养皿中备用。 活体染色后在解 剖镜下即可计数。 有时也可将蔗糖液直接用滤纸过滤, 置该滤纸于解剖镜下计数新鲜有 活力的孢子, 就可测定出单位重量或体积接种剂所含有的孢子数量。 回收蔗糖液可重复 再用。 11. 菌根侵染状况观察与侵染率测定:(1)活体镜检法:将要检查的植物从容器或田间轻轻 挖出, 不要伤根, 用水缓慢洗净根表土壤及其他杂物。 然后, 即可放入培养皿或滤纸上, 在配有冷光源的双目实体镜下,用冷落射光观察。如有菌根侵染,可以看到根上有无隔 菌丝、根外孢子,接至可以看到根内孢子或泡囊等。观察完毕后随即将苗子重新栽植到 原来的位置,令其继续生长。此法的优点是可连续活体观察多次,能及时大体了解菌根 发育情况,并可节省植株。缺点是并不十分准确。(2)染色镜检法:为了精确检查菌根 发育状况、测定侵染率,则需采用染色法。一般要经过根系透明—染色—分色过程。具 体作法是将根段或经过 FAA 固定的根系剪成长 0.5-1.0cm 小段放人试管或其他染色容 器,加入 5%-10%KOH 溶液,放在 90℃水浴锅内 20-60min,通常草本植物的幼嫩根系 透明时间较短,而木本植物的根系则较长。去掉碱液然后用自来水轻轻冲洗根系 3 次, 再加入 2%的 HCl 溶液浸泡酸化 5min。去掉酸液后加入酸性品红(0.01%)乳酸甘油染 色液(乳酸 875ml,甘油 63ml,蒸馏水 63ml,酸性品红 0.1g),再放回 90℃水浴锅内 20-60min,或室温下过夜。回收染色液可重复再用。加入乳酸分色后即可镜检、如用乳 酸酚翠盘蓝(0.05%)染色液(石炭酸 300g,乳酸 250ml,甘油 250ml,蒸馏水 300ml;
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翠盘蓝(Trypan blue 0.5g)则不必加入 HCl 酸化,可以直接染色,并可用水分色。植物 细胞不着色(有时中柱着色), 真菌组织染成红色(酸性品红染色)或蓝色(翠盘蓝染色)。 在 解剖镜或显微镜下可以清晰地看到菌根的组织结构, 并可采用多种方法测定侵染率, 常 用的有方格交叉法和根段频率标准法(Biermann&Lindermanl981)。 这里只介绍比较简便 而精确的根段频率标准法。该方法测定的结果在一定程度上能反映出菌根侵染的程度。 将经过上述染色处理的根样,用镊子和挑针挑选 25 条粗细一致的根段整齐地排列在干 净载玻片上,加盖洁净的盖玻片后即可观察测定。每个处理需要测定 200 条根段。在显 微镜下检查每条根段的侵染情况,根据每段根系菌根结构的多少按 0,10,20,30,… 100%的侵染数量给出每条根段的侵染率。例如,没有菌根结构的根段其侵染率为 0, 如果该条根段全部被侵染则为 100%, 只有一半长度的根段被侵染形成菌根的则该根段 的侵染率为 50%,依此类推,并记录各侵染率下根段的条数。依下列公式即可计算该 样品菌根的侵染率。另外,可利用目镜测微尺测定单位根系长度泡囊、侵入点的数量。 对于根内泡囊、丛枝、菌丝、根外孢子、根上菌丝、侵入点等结构可根据需要拍摄显微 照片。观察所用的玻片放人培养皿内可短期保存。经过上述方法处理的根段,制片并用 光学树脂胶、五色指甲油等封固后可长期保存。 12. 丛枝菌根真菌的接种方法丛枝菌根真菌有多种接种方法, 可根据不同目的和需要选择适 当的接种方法。 然而不管采用何种方法, 操作人员和有关器具必须在接种前进行消毒处 理,以尽量减少污染的机会。对需要接种处理的植物种子、根系、培养植物用的各种容 器和培养基质、 苗床和苗圃土壤等都要消毒甚至灭菌; 对于大田土壤有条件的最好也进 行消毒处理。另外,必须注意,接种剂类型、接种物形式、剂量和接种方法的不同会直 接影响(施亚琴等 1993,Yineta1.1997)丛枝菌根真菌的接种效果。一、按接种物形式区 分的接种方法: 孢子接种法 即以丛枝菌根真菌的孢子作为接种物进行接种处理, 是

常用的接种方法。 可先将孢子从菌剂中分离出来, 挑到滤纸上或放进盛有生理盐水的小 瓶中,便可用来接种。如果菌剂中只含有孢子,可根据单位重量或单位体积孢子含量直 接加入一定重量或体积的菌剂。按孢子用量又可进一步分为:(1)单孢接种 即只挑

一个孢子用来接种。通常用于菌种纯化、分离、分类鉴定等研究目的。事先在灭菌沙中 播种烟草等寄主植物,培养至 3—6 片真叶,即可用于接种处理。解剖镜下用毛细管把 孢子直接放在幼苗根系上,然后将该苗定植于育苗器中,采用半水培法培养 2—4 周后 一般即有菌根侵染。(2)双孢接种 挑出两个相似的孢子接种,类似于单孢接,但接 即挑选外部形态一致的 3 个或多个孢

种成功的机会大于单孢接种法。(3)多孢接种
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子进行接种。可以大大提高接种成功的机会。但有时所接孢子可能不是来自一个种,因 此,该法不宜用来菌种纯化、分离鉴定等工作。但可用于生理效应、生态等研究工作, 如一般每棵幼苗可接 500—1000 个孢子。2.根段接种法 将已充分形成菌根的根段

(侵染率达 80%以上,且含有较多泡囊),剪成小碎段,可用作接种物。一般每个营养钵 接种 0. 2—0. 新鲜根段即可。 5g 无论新鲜或风干的根段, 均可测定出接种势单位数量。 根据需要的接种势单位数量,换算成根段长度或重量,即可接种。3.培养基质接种法 是最常用的丛枝菌根真菌的接种方法。由于用石英砂、纯净的河沙、蛭石、沙土等作培 养基质来繁殖菌种。因此,这些培养基质中含有大量孢子、菌丝、菌根根段或(和)孢子 果等繁殖体, 其接种势较大, 且新鲜的接种物优于风干的。 用此培养基质接种物作菌剂, 侵染成功率高、 速度快。 具体操作上可依上述方法测得单位重量或体积培养基质接种物 的接种势单位数量。 一般每个营养钵或每盆可分别参考施用 5000 或 10 000 接种势单位; 对于苗圃或大田可按每 m2 为 5X10*一 5X10’接种势单位的菌剂进行接种。二、按接 种部位区分的接种方法 1.对种子接种 是播种时或播种前对种子进行的接种处理。

根据不同处理方式,又可将其分为:①种子球衣化接种法:种子球衣化是生产上常用的 方法,大体作法是将接种物、粘合剂与种子一起经过球衣机加工,使种子表面包围一层 均匀的接种剂,凉干后便可播种。此法成本较高。②拌种接种法:将接种剂与种子拌匀 后再播种。2.对幼苗根系接种 对各种来源的组培苗、脱毒苗、少于 6 片真叶的生

长在灭菌基质中的幼苗, 均可将接种剂直接放到根系上或根系周围。 此法菌根侵染速度 较快,如果用新鲜的菌剂则侵染速度会更快。3.对容器接种 当前越来越多的经济

作物采用各种容器育苗,如纸质或塑膜营养钵、各种育苗器、花盆等均常用来短期培育 或栽培植物。可将菌剂与灭菌后的培养基质混匀、装入容器,然后播种或定植幼苗。也 可先将灭菌后的培养基质装入营养钵或育苗器中, 在培养基质上挖数个小穴, 将接种剂 放人穴内;或将接种剂放在容器中部,然后在培养基质表面播种。此法的特点是因容器 体积限定了根系的扩展范围,同时由于菌剂比较集中,故有利于强迫侵染,可以培育出 优质菌根苗,当其侵染率达 50%以上时,便可移栽到苗圃或大田中。4。对苗床和苗圃 接种 在苗床或苗圃基质或土壤上开沟, 然后将接种剂条播到沟内, 最后播种。 对 5. 开沟后可将接种剂撒播到沟内,然后再播种,这样可以减少接种剂用量。

大田接种

如地表撒播,然后耙入土内,接种物用量较多。国外已有用飞机撒播接种物,这在飞播 造林上是常用的方法。三、其他接种方法 1.大田直接定植营养钵接种法 将菌剂加

入营养钵并播种后, 直接将其按一定株行距定植到大田中。 这样可以省去营养钵育苗过
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程。由于菌剂被限制在营养钵内,可以大大提高侵染速率和侵染强度,从而增强接种菌 根真菌的效果。2。多菌混合接种法 所谓多菌混合接种法是指同时将两种或两种以

上丛枝菌根真菌的接种剂, 施加到要进行接种处理的土壤或植物上; 有时也指将丛枝菌 根真菌与外生菌根真菌、根瘤菌、解磷或解钾细菌、其他生防细菌或真菌等同时混合接 种,这是科研上针对不同试验目的采用的方法。3。覆盖作物接种法 即幼龄果园一

般间作花生、大豆、地瓜、三叶草、玉米、小麦等。这些间作物都适合于丛枝菌根真菌 的侵染。因此,在果园间作作物播种同时接种菌根,生长一定阶段后,可增加土壤中丛 枝菌根真菌的数量, 减少土壤中病原物的数量, 从而改善新建果园土壤中微生物区系组 成和土壤健康状况。 作物收获后大部分根系保留于土壤中, 由于这些根系都形成了大量 的菌根,存留在果园土壤中可作为下一年的接种物。另外,先在苗床或苗圃上种植菌根 苗,第二年在这些苗木周围再定植上幼苗。由于它们的根系在土壤中交错,这些小苗的 根系受母苗菌根真菌的感染而形成菌根。此法可靠而简便,但幼苗菌根形成时间较慢。 小 结以上仅简要介绍了与丛枝菌根真菌应用相关的部分常用技术和方法。 如需详细了

解某一技术方法,可从文后找到所附参考资料。不难预见,随着现代科学技术的研究和 发展,必将大大推动菌根研究和应用开发工作。因此,上述应用技术会得到不断改进, 新技术亦会脱颖而出。菌根生物技术及其相关配套技术将在 21 世纪逐渐走向成熟与完 善。

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