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细胞ELISA实验手册(中文版)


细胞 ELISA 实验手册
【waynepionnet 小蚂哥 整理】

一,福尔马林固定细胞 1,用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞; 2,收集细胞并计数; 3,离心,1500rpm,10min; 4,用完全培养基重悬细胞于适当的浓度, 上皮细胞 4×105 个细胞/ml, 纤维细胞 2×105 个细胞/ml; 5,滴加到 96 孔培养板中,100ul/孔; 6,37C 环境孵育过夜; 7,用 PBS 洗板两次; 8,每孔加 125ul 10%福尔马林缓冲液; 9,于室温环境下固定 15min; 10,用双蒸水洗涤三次; 11,晾干; 12,贮存于2-8 C.

二,试剂: 1,PBS:1% BSA 2,PBS:2%BSA 3,碳酸盐缓冲液: 1.59g Na2CO3 2.93g NaHCO3 溶解于 900ml 双蒸水中,检测并调整 pH 至 9.6,定容至 1L; 4,10×底物液,pH6.0 36.6g 一水合柠檬酸 113.5g 磷酸氢二钾 溶解于 900mL 双蒸水中,调 pH 至 6.0,定容至 1L; 5,0.3%H2O2:用双蒸水按 1:100 稀释 30%的双氧水

6,OPD 贮存液,4.0%:4g OPD 溶解于 100ml 双蒸水,分装后保存到-20 C,注意 避光. 7,4.5N H2SO4 12.0mL 浓硫酸 88.0ml 双蒸水混合

三,实验步骤: 1,用双蒸水洗涤 ELISA 板两次; 2,每孔加 250ul 含 2%BSA 的 PBS; 3,37C 孵育 1h; 4,双蒸水洗板三次; 5,每孔加 50ul 腹水,上清,或用含 1%BSA 的 PBS 稀释后的稀释品; 6,37C 孵育 2h; 7,双蒸水洗板五次; 8,每孔加 50ul 用含 1%BSA 的 PBS 稀释的 HRP 酶标抗鼠 IgG; 9,37C 孵育 1h; 10,用双蒸水洗板 5 次.用碳酸盐缓冲液洗两次; 11,加工作浓度底物液 50ul/孔,配方如下: 0.5ml 4.0% OPD 5ul 30%H2O2

1.0 ml 10× 底物缓冲液 8.5ml 双蒸水 12,在室温下孵育 20min; 13,加 4.5N 硫酸溶液 25ul/孔; 14,在酶标仪上测 OD490 波长的值.

注意: 1,检测上清按 1:5 稀释; 2,检测腹水可按 1:100 稀释

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