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现在分子生物学(笔记) 朱玉贤 第三版



第一章 绪论 分子生物学 分子生物学的基本含义 (p8) 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和 相互关系的科学, 是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘, 由被动地适应自然界转向 主动地改造和重组自然界的基础学科。 分子生物学与其它学科的关系 分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学 科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的,凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它 虽产生于上述各个学科,但已形成它独特的理论体系和研究手段,成为一个独立的学科。 生物化学与分子生物学关系最为密切 : 生物化学是从化学角度研究生命现象的科学, 它着重研究生物体内各种生物分子的结构、 转 变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢,包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能 量代谢等与生理功能的联系。 分子生物学则着重阐明生命的本质----主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生 命信息的传递和调控。 细胞生物学与分子生物学关系也十分密切: 传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、 结构与功能。 探讨组成细胞的分子结构 比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能, 因此现代细胞生物学的发展越来越 多地应用分子生物学的理论和方法。 分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手, 但各个分子不能孤立发挥作用, 生命绝 非组成成分的随意加和或混合, 分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和 相互作用,尤其是细胞整体反应的分子机理,这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。 第一章序论 1859 年发表了《物种起源》 ,用事实证明“物竞天择,适者生存”的进化论思想。 指出: 物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的, 彻底否定了 “创世说” 。 达尔文第一个认识到生物世界的不连续性。 意义: 达尔文关于生物进化的学说及其唯物主义的物种起源理论, 是生物科学史上最伟大的 创举之一,具有不可磨灭的贡献。

细胞学说 细胞学说的建立及其意义 德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺共同提出:一切植物、动物都是由细胞组成的,细 胞是一切动植物的基本单位。 经典遗传学 两条基本规律: 统一律:当两种不同植物杂交时,它们的下一代可能与亲本之一完全相同; 分离规律:将不同植物品种杂交后的 F1 代种子再进行杂交或自交时,下一代就会按照一定 的比例分离,因而具有不同的形式。 1865 年发表《植物杂交试验》 ,直到 1900 年才被人们重新发现。孟德尔被公认为经典遗传 学的奠基人。 现代遗传学 Morgan 及其助手第一次将代表某一特性的基因同染色体联系起来,使科学界普遍认识了染 色体的重要性并接受了孟德尔的遗传学原理。 Morgan 特别指出:种质必须由某些独立的要素组成,我们把这些要素称为遗传因子或基因。 第二节 分子生物学发展简史 准备和酝酿阶段(19 世纪后期到 20 世纪 50 年代初) 对生命本质的认识上的两点重大突破: 1.确定了蛋白质是生命的主要基础物质 2.确定了生物遗传的物质基础是 DNA 现代分子生物学的建立和发展阶段(20 世纪 50 年代初到 70 年代初) 这一阶段以 1953 年 Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生 的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。在此期间的主要进展包括: 遗传信息传递中心法则的建立 对蛋白质结构与功能的进一步认识

DNA 双螺旋发现的意义: 确立了核酸作为信息分子的结构基础; 提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式; 从而最后确定了核酸是遗传的物质基础, 为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打 下了最重要的基础。 Crick 于 1954 年所提出遗传信息传递的中心法则(Central Dogma ) :

初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段(20 世纪 70 年代后至今) 基因工程技术的出现作为标志。其间的重大成就包括: 重组 DNA 技术的建立和发展 基因组研究的发展 单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展 基因表达调控机理 细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域 第三节 分子生物学的主要研究内容 一.DNA 重组技术(recombinant DNA technology) 定义:又称为基因工程,根据分子生物学和遗传学的原理,将一种生物的遗传物质 DNA 转 移到另一生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。 DNA 重组技术的应用: 利用微生物基因工程生产重组基因工程药物 转基因植物和动物体细胞克隆 基因表达与调控的基础研究

二.生物大分子的结构功能研究 三.基因组、功能基因组与生物信息学的研究 基因组、蛋白质组与生物信息学 基因组(Genome):细胞或生物体一条完整单体的全部染色体遗传物质的总和。 人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) 测定出人基因组全部 DNA3109 硷基对的 : 序列、确定人类约 5-10 万个基因的一级结构 。 基因组、蛋白质组与生物信息学 蛋白组计划(Proteome project):又称为后基因组计划或功能基因组计划,用于揭示并阐明 细胞、组织乃至整个生物个体全部蛋白质及其功能。 生物信息学(Bioinformatics):是在生命科学的研究中,以计算机为工具对生物信息进行储 存、检索和分析的科学。 四.基因表达调控研究

第二章 染色体与 DNA

本章内容 1. 染色体 2. DNA 的结构 3. DNA 的复制 4. 原核生物和真核生物 DNA 复制特点 5. DNA 的修复 6. DNA 的转座 第一节 染色体(chromosome) 概念:

染色体(chromosome):原指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质。现在这一概 念已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。 染色质(chromatin):由 DNA 和蛋白质构成,在分裂间期染色体结构疏松,称为染色质。其 实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。 常染色质(euchromatin):是进行活跃转录的部位,呈疏松的环状,电镜下表现为浅染,易被 核酸酶在一些敏感的位点(hypersensitive sites)降解。 异染色质(heterochromatin):在间期核中处于凝缩状态,无转录活性,也叫非活动染色质 (inactive chromatin),是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制,早凝缩,即异固缩现象 (heteropycnosis)。 原核细胞与真核细胞特征分析

染色体特性: 分子结构相对稳定 能够自我复制,使亲、子代之间保持连续性 能够指导蛋白质的合成,从而控制整个生命过程 能够产生可遗传的变异 真核细胞染色体的组成 DNA 组蛋白(histone) 非组蛋白(NHP) 少量 RNA 染色体中的蛋白质 组蛋白(histone):一类小的带有丰富正电荷(富含 Lys、Arg)的核蛋白,与 DNA 有高亲和力。 组蛋白是染色体的结构蛋白,它与 DNA 组成核小体。 组蛋白分为 H1、H2A、H2B、H3 及 H4。 30%--40% 30%--40% 变化很大

非组蛋白(non-histone protein):是染色体上与特异 DNA 序列结合的蛋白质,所以又称为序 列特异性 DNA 结合蛋白。

组蛋白具有如下特性: 1、进化上的极端保守性。 2、 无组织特异性。 3、肽链上氨基酸分布的不对称性。 4、组蛋白的修饰作用。 5、富含赖氨酸的组蛋白 H5。 非组蛋白: 非组蛋白大约占组蛋白总量的 60-70%,种类很多。 (1)HMG 蛋白(high mobility group protein) ,能与 DNA 结合(不牢固),也能与 H1 作用,可 能与 DNA 的超螺旋结构有关。 (2)DNA 结合蛋白 :可能是一些与 DNA 的复制或转录有关的酶或调节物质。 (3)A24 非组蛋白 :与 H2A 差不多,位于核小体内,功能不祥。 非组蛋白的一般特性: 1.非组蛋白的多样性; 非组蛋白的量大约是组蛋白的 60%~70%,但它的种类却很多,约在 20-100 种之间,其中 常见的有 15-20 种。 2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 DNA C 值:通常指一种生物单倍体基因组 DNA 的总量。 C 值反常现象:真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能 DNA 序列 大多被不编码蛋白质的非功能 DNA 所隔开,这就是著名的“C 值反常现象” 。

染色体中的 DNA 根据 DNA 的动力学研究,真核细胞 DNA 可分为: 高度重复序列:几百→几万 copy。如:卫星 DNA 和微卫星 DNA。 中度重复序列:10 →几百 copy。如:各种 rDNA、tDNA 及组蛋白基因。 低度重复序列:2 →10 copy。如:血红蛋白。 单拷贝序列:大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。如:蛋清蛋 白。 染色体折叠 DNA 核小体 螺线管 圆筒 超螺旋 (1)核小体 染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体(nucleosome):DNA 绕在组蛋 白八聚体(H2A、H2B、H3、H4 各一对)核心外 1.8 周(146bp),形成核小体核心颗粒。

(2)螺线管 10nm 的染色质细丝盘绕成螺旋管状的 30nm 纤维粗丝, 通称螺线管(solenoid) 。螺线管的每一螺旋包含 6 个核小体,其压缩比为 6。这种螺线管是 分裂间期染色质和分裂中期染色体的基本组分。 (3)上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由 30nm 螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒, 直径为 4 000nm,压缩比是 40。 (4)超螺旋进一步压缩 1/5 便成为染色体单体,总压缩比是 7×6×40×5,将近一万倍。

原核生物基因组 特点: 1、结构简练 2、存在转录单元 3、有重叠基因 Sanger1977 在《Nature》上发表了ΦX174 DNA 的全部核苷酸序列,正式发现了重叠 基因。 多顺反子 mRNA

第二节 DNA 的结构 一、DNA 的一级结构 所谓 DNA 的一级结构,就是指 4 种核苷酸的连接及其排列顺序,表示了该 DNA 分子 的化学构成。 基本特点 ①DNA 分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。 ②DNA 分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接,排在外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键相结合,形成碱基对,它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧 啶配对,而且腺嘌呤(A)只能与胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)只能与胞嘧啶(C)配 对。 2、DNA 的二级结构 DNA 的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 通常情况下,DNA 的二级结构分两大类:一类是右手螺旋,如 A-DNA 和 B-DNA;另一类 是左手螺旋,即 Z-DNA。 3、DNA 的高级结构 DNA 的高级结构是指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构

是 DNA 高级结构的主要形式,可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。 DNA 分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示: L=T+W 其中 L 为连接数(linking number) ,是指环形 DNA 分子两条链间交叉的次数。只要 不发生链的断裂, 是个常量。 为双螺旋的盘绕数 L T (twisting number)W 为超螺旋数 , (writhing number) ,它们是变量。

2.3DNA 的复制 2.3.1 DNA 的半保留复制机理 2.3.2 复制的起点、方向和速度 2.3.3 复制的几种主要方式 一、DNA 的复制 1、DNA 的半保留复制 每个子代分子的一条链来自亲代 DNA,另一条链则是新合成的,所以这种复制方式被 称为 DNA 的半保留复制 (semiconservative replication) DNA 的这种半保留复制保证了 DNA 。 在代谢上的稳定性。 2、复制的起点与方向 一般把生物体的复制单位称为复制子(replicon) 。一个复制子只含一个复制起点。 多复制子:DNA 复制时,原核生物一般只有一个起始位点,而真核生物则有多个起始位点, 因而在复制时呈现多复制泡,也称为多复制子。 DNA 的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的 (图 2-18)复制叉以 DNA 。 分子上某一特定顺序为起点,向两个方向等速生长前进。 拓扑异构酶 I 拓扑异构酶 I 解开负超螺旋,并与解链酶共同作用,在复制起点处解开双链。参与解链的 除一组解链酶外,还有 Dna 蛋白等。 DNA 解链酶(DNA helicase) DNA 解链酶能通过水解 ATP 获得能量来解开双链 DNA。

单链结合蛋白(SSB 蛋白 ) SSB 蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构,它以四聚体 形式存在于复制叉处, 待单链复制后才掉下, 重新循环。 所以, SSB 蛋白只保持单链的存在, 并不能起解链的作用。 3、DNA 的半不连续复制 与冈崎片段 DNA 复制时,短时间内合成的约 1000 个核苷酸左右的小片段,称之为冈崎片段(Okazaki fragment) DNA 复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段,然后再由连接酶连成大分子 DNA。现 在已知一般原核生物的冈崎片段要长些,真核生物中的要短些。进一步研究还证明,这种前 导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的, 因而称之为双螺旋的半不连 续复制。 DNA 链的延伸: DNA 复制体(replisome):在复制叉附近,形成了以两套 DNA 聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和 解链酶构成的类似核糖体大小的复合体,称为 DNA 复制体。 4、滞后链的引发 DNA 复制时, 往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物, 再由 DNA 聚合 酶从 RNA 引物 3' 端开始合成新的 DNA 链。滞后链的引发过程往往由引发体(primosome) 来完成。引发体由 6 种蛋白质 n、n'、n''、Dna B、C 和 I 共同组成,只有当引发前体 (preprimosome) 把这 6 种蛋白质合在一起并与引发酶 (primase) 进一步组装后形成引发体, 才能发挥其功效。 5、链的终止 当复制叉前移,遇到 20bp 重复性终止子序列(Ter)时,Ter-Tus 复合物能阻挡复制叉的 继续前移,等到相反方向的复制叉到达后在 DNA 拓扑异构酶 IV 的作用下使复制叉解体, 释放子链 DNA。 6、复制的几种方式 (1)环状 DNA 双链的复制 环状双链 DNA 的复制可分为θ型、滚环型和 D-环型几种类型。 (a) θ型

复制的起始点涉及到 DNA 双链的解旋和松开,形成两个方向相反的复制叉 。前导链 DNA 开始复制前, 复制原点的核酸序列被转录生成短 RNA 链, 作为起始 DNA 复制的引物。 (b) 滚环型(rolling circle)

这是单向复制的特殊方式。如ΦX174 的双链环状 DNA 复制型(RF)就是以这种方式 复制的。DNA 的合成由对正链原点的专一性切割开始,所形成的自由 5‘ 端被从双链环中 置换出来并为单链 DNA 结合蛋白所覆盖,使其 3’—OH 端在 DNA 聚合酶的作用下不断延 伸。在这个过程中,单链尾巴的延伸与双链 DNA 的绕轴旋转同步 。 (c) D-环型(D-loop) 这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体 DNA 的复制中被发现。 双链环在固定点解开进行复制。 但两条链的合成是高度不对称的, 一条链上迅速合成出互补 链,另一条链则成为游离的单链环(即 D-环) 。 (2)线性 DNA 双链的复制 线性 DNA 复制中 RNA 引物被切除后,留下 5'端部分单链 DNA,不能为 DNA 聚合酶 所作用,使子链短于母链。T4 和 T7 噬菌体 DNA 通过其末端的简并性使不同链的 3'端因互 补而结合,其缺口被聚合酶作用填满,再经 DNA 连接酶作用生成二联体。这个过程可重复 进行直到生成原长 20 多倍的多联体,并由噬菌体 DNA 编码的核酸酶特异切割形成单位长 度的 DNA 分子。 二、原核和真核生物 DNA 的复制特点 1、原核生物 DNA 的复制特点 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I、II 和 III 的性质比较

原核生物的 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶Ⅰ:有 3’→5’外切酶活性和 5’→3’外切酶活性。保证 DNA 复制的准确性。 DNA 聚合酶Ⅱ :活性低,其 3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复 DNA 的 作用。 DNA 聚合酶Ⅲ:7 种亚单位 9 个亚基。只具 3’→5’外切酶活性,主导聚合酶。 Klenow fragment:用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌 DNA 聚合酶,获得两个片段,大片段分 子量 76000U,称为 Klenow 片段。它保留着聚合酶和 3’→5’外切酶的活性,广泛使用于 DNA 序列分析中。

三、真核生物 DNA 的复制特点 真核生物 DNA 复制的起始需要起始原点识别复合物(ORC)参与。 真核生物 DNA 复制叉的移动速度大约只有 50bp 秒,还不到大肠杆菌的 120。 真核生物的染色体在全部完成复制之前,各个起始点上 DNA 的复制不能再开始。 真核生物 DNA 聚合酶的特性比较

2.4.3 DNA 复制的调控 原核细胞 DNA 的复制调控:复制叉的多少决定了复制频率的高低。 真核细胞 DNA 的复制调控: 1.细胞生活周期水平调控 2.染色体水平调控 3.复制子水平调控 真核和原核生物 DNA 复制的比较 相同: 1.半保留复制 2.都有引发、延长、终止三个阶段 3.都必须有相应功能的蛋白质和 DNA 聚合酶参与 区别: 1.真:多个复制起始点;原:一个复制起始点 2.真:所有复制受一种调控;原:一个复制子上有多个复制叉 2.5 DNA 的修复 DNA 修复系统 错配修复 功能 恢复错配

碱基切除修复 核苷酸切除修复 DNA 直接修复 2.6 DNA 的转座 2.6.1 转座子的分类和结构特征 2.6.2 转座作用的机制 2.6.3 转座作用的遗传学效应 2.6.4 真核生物中的转座子

切除突变的碱基 修复被破坏的 DNA 修复嘧啶二体或甲基化 DNA

移动基因(Movable gene):又称为转位因子(Transposable elements),是存在于染色体 DNA 上 可自主复制和位移的基本单位。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置, 甚至在不同染色体之间跃迁,因此有时也称为跳跃基因(Jumping gene)。 原核生物的转座因子可分为: 插入序列(insertion sequence,IS):最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。片段长度 700 —2500bp。 复合转座子(transposon,Tn):是一类携带某些与转座无关的抗性基因(或其它宿主基因)的转 座子。分子量>2000bp。 转座噬菌体(Mu,D108):具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。 插入序列的结构特点: 1.在 IS 两端含有长度为 10—40bp 反向重叠序列 2.含有一个编码转座酶的长编码区。 3.插入时在 DNA 位点产生一个短的(3—9bp)正向重复序列。 复合转座子的结构特点: 1.两翼为两个相同或相似的 IS 序列。 2.中部为某种抗性基因。

3.IS 序列一般不能单独移动。 Conclusion a) 转座过程是由 Donor 提供 Tn copy 到 target site, 涉及酶切、 复制、 重组的遗传学过程。 b) 转座完成后, Tn 的两端出现 target site 序列的正向重复, 在 其长度取决于 staggered cutting 的长度。 c) 转座因子的 IR 序列是转座酶的重要识别位点,与转座,切除有关 d) Cointegrater 是转座过程的中间体 (具有两个 Tn 和两个 replicon), 其稳定性依 Tn 不 同而异,或 resolution 完成转座过程. e) Cointegrater 可能导致 Tn 和抗性的积累。 转座作用的遗传学效应 1. 2. 3. 4. 5. 诱变效应 (提高重组频率、形成易变基因…) 切除效应 (倒位、缺失、重复、footprinting) 双转座效应(外显子改组 exon shuffling ) 位置效应(启动表达、增强表达…) 转座爆炸(激活表达、基因内重排突变基因形成)

转位作用的机制:靶序列的复制。 转位作用的遗传学效应:引起插入突变;产生新基因;产生染色体畸变;引起生物进化。 转座因子的应用:利用转座子分离、克隆基因;利用 Tn 进行基因定位;作为基因转移载体。 真核生物中的转座子 1、玉米中的控制因子 自主性因子:具有自主剪接和转座的功能; 非自主性因子:单独存在时是稳定的,不能转座,当基因组中存在与非自主性因子同家族的 自主性因子时,它才具备转座功能,成为与自主性因子相同的转座子。

Ac-Ds 体系、Spm, En 转座子。 2、果蝇中的转座子 Copia 类、P 转座子等。 本章重点 染色体及 DNA 结构 习题 1.DNA 以半保留方式进行复制,若一完全被标记的 DNA 分子,置于无放射标记的溶液中复制 两代,所产生的 4 个 DNA 分子中放射性状况如何 A.两个分子有放射性,两个分子无放射性 C.两条链中的半条具有放射性 E.均无放射性 2.DNA 复制时哪种酶不需要 A.DNA 指导的 DNA 聚合酶 D.RNA 指导的 DNA 聚合酶 3.原核生物的 DNA 聚合酶 A.DNA 聚合酶Ⅰ有 7 种、9 个亚单位 B.DNA 聚合酶Ⅱ有最强的外切核酸酶的活性 C.DNA 聚合酶Ⅲ是真正的起复制作用的酶 D.催化过程产生的焦磷酸是主要底物 E.用 4 种脱氧核苷作底物 B.DNA 指导的 RNA 聚合酶 E.拓扑异构酶 C.连接酶 B.均有放射性 DNA 复制

D.两条链中的一条具有放射性

生物信息的传递(上)—从 DNA 到 RNA 基因表达:是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。 转录(transcription):以 DNA 为模板,按照碱基互补原则合成一条单链 RNA,从而将 DNA 中的遗传信息转移到 RNA 中去的过程称为转录。 编码链(coding strand)=有意义链

模板链(template strand)=反义链 不对称转录(asymmetric transcription):转录仅发生在 DNA 的一条链上。 启动子(promoter):是 DNA 转录起始信号的一段序列,它能指导全酶与模板正确的结合,并 活化酶使之具有起始特异性转录形式。 终止子(terminator):转录终止的信号,其作用是在 DNA 模板特异位置处终止 RNA 的合成。 转录单位:DNA 链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。 3.1 RNA 的转录 转录的基本过程都包括:模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。 1、模板识别阶段主要指 RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。转 录起始前,启动子附近的 DNA 双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板 DNA 的 碱基配对。 2、转录起始就是 RNA 链上第一个核苷酸键的产生。 3、转录起始后直到形成 9 个核苷酸短链是通过启动子阶段,通过启动子的时间越短,该基 因转录起始的频率也越高。 4、RNA 聚合酶离开启动子,沿 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断伸长的过程就是转录的 延伸。 5、当 RNA 链延伸到转录终止位点时,RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯键,RNA-DNA 杂合物分离,这就是转录的终止。 3.1.1 转录的基本过程 RNA 合成的基本特点: 1.底物是:ATP、GTP、CTP、UTP 2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键 3.RNA 的碱基顺序由 DNA 的顺序决定 4.仅以一条 DNA 链作为模板 5.合成方向为 5’→3’

6.合成中不需要引物 3.1.2 转录机器的主要成分 原核生物 RNA 聚合酶:

亚基 基因 α rpoA

相对分子量 亚基数 3.65×10 4 2

组分 核心酶

功能 核心酶组装, 启动子识别

β

rpoB

1.51×10 5

1

核心酶

β和β’ 共同形成 RNA 合成的活性中心

β’ rpoC ? σ rpoD

1.55×10 5 11×10 4 7.0×10 4 1

1

核心酶 核心酶 σ因子 未知 存在多种σ因子,用 于识别不同的启动子

1

1、RNA 聚合酶 大多数原核生物 RNA 聚合酶的组成是相同的,大肠杆菌 RNA 聚合酶由 2 个α亚基、一 个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成,称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶 全酶(holoenzyme) ,相对分子质量为 4.65×105。研究发现,由β和β’亚基组成了聚合酶 的催化中心,它们在序列上与真核生物 RNA 聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模 板 DNA、新生 RNA 链及核苷酸底物相结合。

σ因子可以极大地提高 RNA 聚合酶对启动子区 DNA 序列的亲和力, 加入σ因子以后, RNA 聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了 107 倍。 σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始, 转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生 RNA 的 5’端,再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合,起始的终止反映在σ因子的释放。 过去认为二核苷酸的形成就是转录起始的终止,实际上,只有当新生 RNA 链达到 6-9 个核 苷酸时才能形成稳定的酶-DNA-RNA 三元复合物,才释放σ因子,转录进入延伸期。 真核生物 RNA 聚合酶 真核生物中共有 3 类 RNA 聚合酶。真核生物 RNA 聚合酶一般有 8-14 个亚基所组成,相 对分子质量超过 5×105。

除了细胞核中的 RNA 聚合酶之外,真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的 RNA 聚合 酶。线粒体 RNA 聚合酶只有一条多肽链,相对分子质量小于 7×104,是已知最小的 RNA 聚合酶之一,与 T7 噬菌体 RNA 聚合酶有同源性。叶绿体 RNA 聚合酶比较大,结构上与细 菌中的聚合酶相似, 由多个亚基组成, 部分亚基由叶绿体基因组编码。 线粒体和叶绿体 RNA 聚合酶活性不受α-鹅膏覃碱所抑制。

常用的转录抑制剂及其作用: 抑制剂 利福霉素 链霉溶菌素 放线菌素 D α-鹅膏蕈碱 靶酶 细菌的全酶 细菌的核心酶 抑制作用 与β亚基结合,阻止起始 与β亚基结合,阻止延长

真核 RNA 聚合酶Ⅰ 与 DNA 结合,并阻止延长 真核 RNA 聚合酶Ⅱ 与 RNA 聚合酶Ⅱ结合

起始复合物的形成 转录可被分为 4 个阶段,即启动子的选择、转录起始、RNA 链的延伸和终止。 原核生物中:启动子选择阶段包括 RNA 聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆 性结合形成封闭复合物(closed complex) 。

真核生物 RNA 聚合酶Ⅱ所形成的转录起始复合物:除了 RNA 聚合酶之外,真核生物转录 起始过程中至少还需要 7 种辅助因子参与 一般情况下,该复合物可以进入两条不同的反应途径, 一是合成并释放 2-9 个核苷酸的短 RNA 转录物,即所谓的流产式起始; 二是尽快释放σ亚基, 转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、 DNA 和新生 RNA 所组成的转录延伸复合物。 RNA 聚合酶的核心酶虽可合成 RNA,但不能找到模板 DNA 上的起始位点。 只有带б因子的全酶才能专一地与 DNA 上的启动子结合,选择其中一条链作为模板,合成 均一的产物。б因子的作用只是起始而已,一旦转录开始,它就脱离了起始复合物,而由核 心酶负责 RNA 链的延伸。因此,聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始,而核心 酶的作用是链的延伸。 真核生物 RNA Pol II 的转录起始复合物 真核生物转录起始除 RNA 聚合酶外, 至少还需要 7 种辅助因子参与, TBP, 如 TFIIA, TFIIB, TFIID,TFIIE,TFIIF 和 TFIIH。 3.2 启动子与转录起始 2、启动子与转录起始 启动子是一段位于结构基因 5’端上游区的 DNA 序列,能活化 RNA 聚合酶,使之与范本 DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性。 转录的起始是基因表达的关键阶段,而这一阶段的重要问题是 RNA 聚合酶与启动子的相 互作用。

3.2.1 启动子区的基本结构 转录单元(transcription unit):是一段从启动子开始至终止子结束的 DNA 序列,RNA 聚合酶 从转录起点开始沿着模板前进,直到终止子为止,转录出一条 RNA 链。 转录起点是指与新生 RNA 链第一个核苷酸相对应 DNA 链上的碱基,研究证实通常为一个 嘌呤。 常把起点前面,即 5’末端的序列称为上游(upstream),而把其后面即 3’末端的序列称为下

游(downstream)。 在启动子区内有一个由 5 个核苷酸组成的共同序列,是 RNA 聚合酶的紧密结合点,现在称 为 Pribnow 区(Pribnow box),这个区的中央大约位于起点上游 10bp 处,所以又称为-10 区。 绝大部分启动子都存在位于-10bp 处的 TATA 区和-35bp 处的 TTGACA 区。这两段共同序列 是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点,能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。 Pribnow 区(Pribnow box)这个区的中央大约位于起点上游 10bp 处,所以又称为–10 区。 TTGACA。这个区的中央大约位于起点上游 35bp 处,所以又称为–35 区。 –10 位的 TATA 区和–35 位的 TTGACA 区是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点,能与σ因 子相互识别而具有很高的亲和力。 在真核生物基因中,Hogness 等先在珠蛋白基因中发现了类似 Pribnow 区的 Hogness 区 (Hogness box) ,这是位于转录起始点上游–25~–30 bp 处的共同序列 TATAAA,也称为 TATA 区(图 3-7) 。 另外, 在起始位点上游–70~–78 bp 处还有另一段共同序列 CCAAT, 这是与原核生物中– 35 bp 区相对应的序列,称为 CAAT 区(CAAT box) 。 在–70~–80 区含有 CCAAT 序列(CAAT box) ,在–80~–110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGG 序列(GC box) 。 3.2.2 启动子区的识别 氢键互补学说:RNA 聚合酶并不直接识别碱基对本身,而是通过氢键互补的方式加以识别。 这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受 DNA 序列影响,又受其构象影响这一 事实。 3.2.3 酶与启动子区的结合 在 RNA 聚合酶与启动子相互作用的过程中, 聚合酶首先与启动子区闭合双链 DNA 相结合, 形成二元闭合复合物,然后经过解链得到二元开链复合物。 DNA 开链是按照 DNA 模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。 RNA 聚合酶既是双链 DNA 结合蛋白,又是单链 DNA 结合蛋白。 3.2.4 -10 区和-35 区的最佳间距

在原核生物中, 区与-10 区之间的距离大约是 16~19bp, -35 小于 15bp 或大于 20bp 都会降低

启动子的活性。 在细菌中常见两种启动子突变,一种叫下降突变(down mutation),如果把 Pribnow 区从 TATAAT 变成 AATAAT 就会大大降低其结构基因的转录水平;另一类突变叫上升突变(up mutation),即增加 Pribnow 区共同序列的同一性。 3.2.5 增强子及其功能 能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。 增强子很可能通过影响染色质 DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结 构,从而使得 RNA 聚合酶更容易与范本 DNA 相结合,起始基因转录。 增强子与启动子的区别: 1.增强子对于启动子的位置不固定,而能有很大的变动; 2.它能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录,它能刺激在 它附近的任一启动子。 3.2.6 真核生物启动子对转录的影响 习惯上,将 TATA 区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element,UPE) 或称上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)。 在真核生物基因中,Hogness 等先在珠蛋白基因中发现了类似 Pribnow 区的 Hogness 区 (Hogness box) ,这是位于转录起始点上游–25~–30 bp 处的共同序列 TATAAA,也称为 TATA 区。 另外, 在起始位点上游–70~–78 bp 处还有另一段共同序列 CCAAT, 这是与原核生物中– 35 bp 区相对应的序列,称为 CAAT 区(CAAT box) 。 在–70~–80 区含有 CCAAT 序列(CAAT box) ,在–80~–110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGG 序列(GC box) 。 TATA 区的主要作用是使转录精确地起始; CAAT 区和 GC 区主要控制转录起始频率,基本不参与起始位点的确定。 转录实际上是 RNA 聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。 转录的终止 RNA 聚合酶起始基因转录后,它就会沿着范本 5’→3’方向不停地移动,合成 RNA 链, 直到碰上终止信号时才与模板 DNA 相脱离并释放新生 RNA 链。终止发生时,所有参与形

成 RNA-DNA 杂合体的氢键都必须被破坏,范本 DNA 链才能与有意义链重新组合成 DNA 双链。 3.4 终止和抗终止 不依赖于ρ因子的终止 终止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的二重对称区,由这段 DNA 转录产生的 RNA 容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由 4-8 个 A 组成的序列,所以转录产物的 3’ 端为寡聚 U,这种结构特征的存在决定了转录的终止。终止效率与二重对称序列和寡聚 U 的长短有关,随着发卡式结构(至少 6bp)和寡聚 U 序列(至少 4 个 U)长度的增加,终止 效率逐步提高。 依赖于ρ因子的终止 ρ因子是一个相对分子质量为 2.0×105 的六聚体蛋白,它能水解各种核苷酸三磷酸,实 际上是一种 NTP 酶,它通过催化 NTP 的水解促使新生 RNA 链从三元转录复合物中解离出 来,从而终止转录。 3.4.3 抗终止 抗转录终止主要有两种方式: 1.破坏终止位点 RNA 的茎—环结构 2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止 3.3 原核生物与真核生物 mRNA 的特征比较 原核生物 mRNA 的特征 mRNA 在大肠杆菌细胞内占总 RNA 的 2%左右(tRNA 占 16%,而 rRNA 则占 80%以 上) 。原核生物中,mRNA 的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里,而且这两个过程几 乎是同步进行的,蛋白质合成往往在 mRNA 刚开始转录时就被引发了。一个原核细胞的 mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽。

3.3.1 原核生物 mRNA 的特征 1.原核生物 mRNA 的半衰期短 2.许多原核生物 mRNA 以多顺反子的形式存在

3.原核生物 mRNA 的 5’端无帽子结构,3’端没有或只有较短的 poly(A)结构 4.原核生物起始密码子 AUG 上游 7-12 个核苷酸处有一被称为 SD 序列(Shine –Dalgarno sequence)的保守区,因为该序列与 16S-rRNA 3’端反向互补,所以被认为在核糖体-mRNA 的结合过程中起作用。 只编码一个蛋白质的 mRNA 称为单顺反子 mRNA(monocistronic mRNA) , 把编码多个蛋白质的 mRNA 称为多顺反子 mRNA(polycistronic mRNA) 。 多顺反子 mRNA 是一组相邻或相互重迭基因的转录产物,这样的一组基因可被称为一个操 纵子(operon) ,是生物体内的重要遗传单位。如大肠杆菌乳糖操纵子转录成编码 3 条多肽 的多顺反子 mRNA,经过翻译生成β半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶。 真核生物 mRNA 的特征 前体 RNA 成熟 mRNA

“基因”的分子生物学定义是:产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核苷酸序列! 3.3.2 真核生物 mRNA 的特征 1. 真核生物 mRNA 的 5’端存在“帽子”结构:pppApNpNp 。 2. 绝大多数真核生物 mRNA 具有多聚(A)尾巴。 帽子结构 帽子被扣在了 mRNA 的 5’端,并可能在几个位置发生甲基化。 mRNA5′端加“G”的反应是由鸟苷酸转移酶完成的 。 帽子甲基化作用 帽子 0:出现在所有真核生物中。 尿苷酸一 7 一甲基转移酶 在 G 的 7N 位甲基化

帽子 1:除单细胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。 2’一甲基一转移酶 第 2 个碱基的 2’-OH 位置上(实际上在任何修饰反应进行前,它是转录物中原来的第 1 个碱基)

帽子 2:甲基基团可以添加到戴帽 mRNA 的第 3 碱基上。这个反应的底物是已经具有两个 甲基基团的帽子 mRNA。 2’一甲基一转移酶催化 2’-OH 位置上甲基化 这种帽子通常低于戴帽群体总量的 10-15%。 二、mRNA 的转录后修饰---------帽子 1、 帽子的种类 帽子 0(Cap-0) m7GpppXpYp----------(共有)

帽子 1 (Cap-1) m7GpppXmpYp----------第一个核苷酸的 2’-O 位上产 生甲基化 (A N6 位甲基化) 帽子 2(Cap-2) 甲基化(A、G、C、U) 其中: ☆ ☆ ☆ 单细胞真核生物只有 Cap—0 Cap—1 是其余真核生物的主要帽子形式 Cap—2 存在于某些真核生物中 m7GpppXmpYm 第二个核苷酸的 2’-O 位上产生

2、 帽子结构的生成 ☆ ☆ 甲基供体都为 S—腺苷甲硫氨酸(SAM) RNA 鸟苷酸转移酶-----戴帽酶(capping enzyme)

3、 帽子结构的功能 (1) 对翻译起识别作用------为核糖体识别 RNA 提供信号 Cap—0 的全部都是识别的重要信号 Cap—1,2 的甲基化能增进识别 (2) 增加 mRNA 的稳定性,使 5’端免遭外切核酸酶的攻击

(3) 与某些 RNA 病毒的正链合成有关 (Cap—1、 Cap—2 )

除帽子结构外的 Euk.mRNA 内部甲基化---m6A 形式 Poly A 尾巴 3、 poly(A) 的功能 (1) 可能与核质转运有关 (2) 与 mRNA 的寿命有关 (3) 与翻译有关 a、 缺失可抑制体外翻译的起始 b、 胚胎发育中,poly(A) 对其 mRNA 的翻译有影 响(非 poly(A) 化的为储藏形式) c、对含 poly(A) 的 mRNA 失去 poly(A) 可减弱其翻译 (4) poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值 a、 也可将 oligo (dT) 与载体相连,从总体 RNA 中分离 纯化 mRNA b、 用寡聚 dT(oligo (dT))为引物,反转录合成 cDNA

若 干 基 本 概 念 基因表达的第一步 以 D. S. DNA 中的一条单链作为转录的模板 在依赖 DNA 的 RNA 聚合酶的作用下 按 A = U,C=G 配对的原则,合成 RNA 分子

模板单链 DNA 的极性方向为 3’ →

5’, 而非模板单链

DNA 的极性方向与 RNA 链相同,均为 5’ → 3’. 模板单链 DNA 的极性方向为 3’ → 5’, 而非模板单链

DNA 的极性方向与 RNA 链相同,均为 5’ → 3’.

3.5 内含子的剪接、编辑及化学修饰 一、概述 割裂基因(split gene) :指编码某一 RNA 的基因中有些序列并不出现在成熟的 RNA 序 列中,成熟 RNA 的序列在基因中被其他的序列隔开 内含子(intron) :原初转录物中通过 RNA 拼接反应而被去除的 RNA 序列或基因中与这 些 RNA 序列相应的 DNA 序列 外显子(excon) : RNA 拼接(RNA splicing) :一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中, 将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟 RNA 分子的过程 拼接点: 5’ 拼接点或左拼接点(内含子上游) 3’ 拼接点或右拼接点(……下游) 3.5.1 RNA 中的内含子 真核生物 mRNA 前体的加工: 1. 5’端形成特殊的帽子结构 2. 在 3’端切断并加上一个 poly(A)的尾巴 3. 通过剪接除去转录来的 IVS(非翻译区) 4. 链内部核酸的甲基化 内含子的分类 中部核心结构(central core structure):在有些内含子中,含有 4 个重复的保守序列,长 度为 10 ~ 20bp,4 个保守序列构成一种二级结构,在拼接中起重要作用

由于并非所有的内含子都有中部核心结构,所以有了内含子的分类 Ⅰ类(group Ⅰ):含有中部核心结构的细胞器基因 核基因 核基因

Ⅱ类(group Ⅱ):不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内

Ⅲ类(group Ⅲ):具有 GU-AG 特征的边界序列核基因 mRNA 前体 RNA 基因的内元均位于 tRNA 的反密码环上 3、拼接方式 方式一:由拼接装置完成(核 mRNA 内含子)可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋 白质和核蛋白组成 方式二:自我拼接(两类内含子Ⅰ 、Ⅱ )形成特定的二级结构 RNA 具有催化拼接的 能力 方式三:需要蛋白质酶参与的拼接(酵母 tRNA)前两种拼接都属于转酯反应 3.5.2 RNA 的剪接 RNA 的剪接实质:就是要把断裂基因的内含子除去,连接外显子。 剪切方式:mRNA 前体的剪接;自我剪接;蛋白质剪接(tRNA)。 剪接体(spliceosome):各种参与剪接的成分形成的一个体系。 Ribozyme:有酶活性的 RNA。 拼接机制(Splicing mehanism )

SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接, 形成拼接体( spliceosome)。 Spliceosome 逐级组装, SnRNA(U1、U2、U5 和 U4/U6)分步替代 U1 通过 5,拼接点互补而结合 U2 识别并结合分支点 A U1 和 U2 作用使内元 的 5’端和 3’端带到 一起(U1 与 3’拼接点配对) U1、U2、mRNA 与 U4-U5 -U6 复合物形成一个完整的拼接体 3.5.3 RNA 的编辑和化学修饰

RNA 的编辑:是在 mRNA 水平上改变遗传信息的过程。 种类:单碱基突变;尿苷酸的缺失和添加 化学修饰:甲基化;硫代;二价键的饱和化;去氨基化;碱基的同分异构化;核苷酸的替代。 习题 1.真核生物的 TATA 盒是: A.转录的起 始点 B.翻译 的起始点 C.RNA 聚合酶 与 DNA 模板稳 定结合处 D.DNA 聚合酶的活性中心 E.DNA 合成起始位点 2.关于 RNA 的叙述,错误的是: A.主要有 mRNA、tRNA、rRNA 三大类 B.胞质中只有一种 RNA,即 mRNA 的一种 RNA 是 tRNA D.原核生物没有 hnRNA E.原核生物没有 snRNA 3.真核细胞中 mRNA 的加工修饰不包括: A.在 mRNA 3’末端加 poly A 尾 B.mRNA 的前体是核内 hnRNA D.除去非结构信息部分 C.最小

C.在 mRNA 5’端形成 7 甲基鸟苷酸帽子结构 E.不同 RNA 片段之间的拼接 4.绝大多数真核生物 mRNA 5’端有: A.帽式结构 B.poly A C.起始密码子

D.启动子

E.SD 序列

5. snRNA 的功能是:B A.参与 DNA 复制 rRNA 的前体 B.参与 RNA 剪接 C.激活 RNA 聚合酶 D.形成核糖体 E.是

6.核酶(ribozyme)的底物是: A.DNA B.RNA C.核糖体 D.细胞核膜 7.反义核酸作用主要是: E.核蛋白

A.封闭 DNA E.封闭核糖体

B.封闭 RNA

C.降解 DNA

D.降解 RNA

8.转录与 DNA 复制过程的共同点是: A.需要 DNA 聚合酶 D.所得产物相同 B.所用模板相同 C.所用原料相同

E.需要 RNA 聚合酶

1.真核生物 mRNA 转录后的成熟步骤主要包括 ① 5’端形成特殊的帽子结构 ②在 3’端切断并加上一个 poly(A)的尾巴 ③通过剪接除去转录来的 IVS(非翻译区) ④链内部核酸的甲基化 生物信息的传递(下)—从 mRNA 到蛋白质 4.1 遗传密码—三联子 1、mRNA 与蛋白质之间的联络是经过遗传密码的破译来完成的 4.1.1 三联子密码及其破译 遗传密码(code):mRNA 中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码,密码是密码子的总和。 密码子(codon): mRNA 中每个相邻的三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这 三个核苷酸就称为一个密码子。 阅读框(reading frame):遗传密码是三个一读,称为阅读框。 AUG:蛋氨酸(Met)或起始密码 UAA、UAG、UGA:终止密码 UAG—琥珀型(amber)密码子 UGA—蛋白石(opal)密码子 UAA—赭石型(ochre)密码子 三联体密码的破译:

以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指点多肽的分解 核糖体结合技术 4.1.2 遗传密码的性质 1.密码的简并性: 简并(Degenracy):由一种以上密码子编码同一种氨基酸的景象称为简并。 同义密码子(Synonymous codons):对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。 2.密码的普遍性与特殊性: 普遍性:无论在体外还是体内,也无论是病毒、细菌、植物还是植物,遗传密码均适用。 特殊性:线粒体密码子,其它例外(支原体、四膜虫) 线粒体 mRNA 中的密码子: 与胞浆中 mRNA 的密码子有三点不同(哺乳植物): 1.线粒体中 UGA 不代表终止密码子,而是编码 Trp; 2.由 AUG 和 AUA 二个密码子编码; 3.AGA 和 AGG 不是 Arg 的密码子,而是终止密码子,即 UAA、UAG、AGA 和 AGG 均为 终止密码子。 密码子与反密码子的互相作用: 反密码子(anticodon):指 tRNA 上能辨认一个 mRNA 密码子的地位,这个地位上的碱基与密 码子的碱基是互补的。 所谓“摆动假说”(Wobble hypothesis):即密码的第一、第二碱基是必需严厉依照规范配对 (A-U、G-C),而第三碱基则可以有一定水平的摆动灵敏性。 Wobble hypothesis: 1.恣意一个密码子的前两位碱基都与 tRNA anticodon 中的相应碱基构成 Watson-Crick 碱基配 对。 2.反密码子第一位是 A 或 C 时,只能辨认一个密码子。当反密码子第一位是 U 或 G 时,能

辨认两个密码子。当 Inosine(I)作为反密码子第一位时,能辨认三个密码子。 3.假如数个密码子同时编码一个氨基酸,但凡第一、二位碱基不相反的密码子都对应于各自 的 tRNA。 4.依据上述规则,至多需求 32 种不同的 tRNA 才干翻译 61 个 codons(密码子)。 密码子—反密码子配对摆动的准绳: 反密码子 5’端 密码子 3’端 G U or C C G only A U only U A or G I U,C or A 遗传密码子的根本特点: 1.每个密码子三联体(triplet)决议一种氨基酸; 2.两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以别离,即密码子无逗号; 3.密码子具无方向性,从 N 端到 C 端; 4.密码子有简并性; 5.共有 64 个密码子,其中有 1 个起始密码子和 3 个终止密码子; 6.密码子有通用性,即不管是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相反的。 二、tRNA tRNA 的二级构造(三叶草构造) 1. 3’端含 CCA-OH 序列 2. TψC 环(TψC loop):7 个碱基 3.额定环(extro variable loop):3-18 个碱基

4.反密码环(anticodon loop):7 个碱基 5.二氢尿嘧啶环(dihydr-Uloop 或 D-loop):8-12 个碱基 6.螺旋区:4-5 个碱基 4.2 tRNA 4.2.1 tRNA 的 L 形三级构造 tRNA 的三级构造次要由在二级构造中未配对碱基间构成氢键而引发的。在三叶草构造中的 氢键被称为次级氢键, 在三级构造中的就称为三级氢键。 大局部恒定或半恒定核苷酸都参与 三级氢键的构成。 4.2.2 tRNA 的功用 在蛋白质生物分解进程中,tRNA 次要起转运氨基酸的作用。 tRNA 上与多肽链分解有关的位点: 1. 3’端—CCA 上的氨基酸承受位点 2. 辨认氨酰 tRNA 分解酶的位点 3. 核糖体辨认位点 4. 反密码子位点 4.2.3 tRNA 的品种 起始 tRNA; 延伸 tRNA; 同工 tRNA; 校正 tRNA。 校正 tRNA:分为无义渐变及错义渐变校正 在蛋白质的构造基因中, 一个核苷酸的改动能够使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子 (UAG、UGA、UAA),使蛋白质分解提早终止,分解无功用的或有意义的多肽,这种渐变 就称为无义渐变。

错义渐变:由于构造基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密 码。 4.2.4 氨酰– tRNA 分解酶 是一类催化氨基酸与 tRNA 结合的特异性酶,其反响式如下: AA+tRNA+ATP → AA-tRNA+AMP+PPi 它实践上包括两步反响: 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。 AA+ATP+酶(E)→ E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基转移到 tRNA 3 末端腺苷残基的 2 或 3-羟基上。 E-AA-AMP+tRNA → AA-tRNA+E+AMP 4.3 核糖体 4.3.3 核糖体的功用 4.3.1 核糖体的构造 由几十种蛋白质和几种 rRNA 组成。 包括两个亚基,大亚基约为小亚基绝对分子质量的一倍。每个亚基包括一个次要的 rRNA 成 分和许多不同功用的蛋白质分子。 核糖体上有不止一个的活性中心,每一个这样的中心都由一组特殊的蛋白质构成。 核糖体的根本功用依赖于其中的 rRNA,核糖体蛋白质起着增强 rRNA 功用的作用。 多聚核糖体(polyribosome): 在执行蛋白质分解功用时, 单个核糖核蛋白体常常 5-6 个或更多 个串联在一同,构成一个聚合体,称为多核蛋白体或多核糖体(polyribosome 或 polysome)。 4.3.2 rRNA rRNA 的根本特点 1. rRNA 是单链 RNA。

2.G-C 碱基对与 A-U 碱基对的总量不等。 3.单股 rRNA 链可自行折叠,构成螺旋区和环区,一切螺旋区的碱基都是保守的。 4.一切来源 rRNA 均能构成 4 个构造域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),每个构造域均含许多茎(螺旋段) 和环,它们经过无间隔碱基对的互相反响彼此接近。 5.绝大少数的 rRNA 碱基的特异功用尚不清楚。 rRNA 1、5S rRNA: 含与 tRNA 和 23S rRNA 辨认序列 2、16S rRNA:含与 mRNA5’端和 23SrRNA 互补序列。 3、23S rRNA :存在一段能与 tRNAMet 序列互补的片段,5S rRNA 互补序列。 4、5.8S rRNA :与 tRNA 作用的辨认序列,同 5SrRNA。 5、18S rRNA :与 16SrRNA 同源。 6、28S rRNA 4.3.3 核糖体的功用 核糖体必需包括至多 5 个活性中心, mRNA 结合部位、 即 结合或承受 AA-tRNA 部位 位) (A 、 结合或承受肽基 tRNA 的部位、肽基转移部位(P 位)及构成肽键的部位(转肽酶中心) 。 核糖体小亚基担任对模板 mRNA 停止序列特异性辨认,如起始局部的辨认、密码子与反密 码子的互相作用等,mRNA 的结合位点也在此亚基上 大亚基担任携带氨基酸及 tRNA 的功用,肽键的构成、AA-tRNA、肽基-tRNA 的结合等,A 位、P 位、转肽酶中心等次要在大亚基上。 4.4 蛋白质合成的生物学机制 4.4.1 氨基酸的活化 氨基酸必须在氨基酰-tRNA 合成酶的作用下生成活化氨基酸 合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。 氨基酸必须在氨基酰 。

tRNA 与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤, 与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤, 因为只要 tRNA 携带了正确的氨基 酸,多肽合成的准确性就相对有了保障。 多肽合成的准确性就相对有了保障。

4.4.2 翻译的起始 起始密码子和起始信号: 起始密码子和起始信号:

1.mRNA 上的起始密码子常为 AUG,少数为 GUG , 2.在 mRNA 起始密码子上游 8-13 个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列,称为 在 个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列, Shine-Dalgarno 序列,简称 SD 序列。它和 16S rRNA 3’端有一个互补的序列,它们互相识 序列, 序列。 端有一个互补的序列, 端有一个互补的序列 别,以保证起始的正确性。 以保证起始的正确性。

Eukaryotic ribosomes migrate from the 5 end of mRNA to the ribosome binding site, which includes an AUG initiation codon. 翻译的起始 :

第一步, 结合, 第一步,30S 小亚基首先与翻译起始因子 IF-1, ,IF-3 结合,再在 SD 序列的帮助下与 mRNA 模板结合。 模板结合。

第二步, 的帮助下, 第二步,在 IF-2 和 GTP 的帮助下,fMet-tRNAfMet 进入小亚基的 P 位,tRNA 上的反密码 上的起始密码子配对。 子与 mRNA 上的起始密码子配对。 第三步,带有 tRNA,mRNA,三个翻译起始因子的小亚基复合物与 50S 大亚基结合,GTP 第三步, , , 亚基结合, 水解,释放翻译起始因子。 水解,释放翻译起始因子。

原核生物的翻译的起始因子: 原核生物的翻译的起始因子:

IF-1 9.5kd

加强 IF-2,IF-3 的酶活 ,

IF-2 95kd-117kd 促使 fMet-tRNAfMet 选择性的结合在 30S 亚基上 起始部分, 促使 30S 亚基结合于 mRNA 起始部分,阻碍 30S 与 50S 亚基的结合

IF-3 20kd 真核生物

蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同,其差异主要是核糖体较大, 蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同,其差异主要是核糖体较大,有较多的起
7 Met 始因子参与, 帽子结构, 不甲酰化, 始因子参与,其 mRNA 具有 m GpppNp 帽子结构,Met-tRNA 不甲酰化,mRNA 分子

5' 端的 帽子” 参与形成翻译起始复合物。 端的“帽子 参与形成翻译起始复合物。 帽子 真核生物的翻译的起始因子: 真核生物的翻译的起始因子:

eIF2

3 种亚基

形成三元起始复合体(eIF2,GTP,tRNA) 形成三元起始复合体

eIF2-A

65kd

Met-tRNAmet 与 40S 亚基结合 促使 mRNA 与 40S 亚基结合 促使 mRNA 与 40S 亚基结合 促使 mRNA 与 40S 亚基结合 促使与 mRNA,GTP 结合 , 促使两亚基结合

eIF1

15kd >500kd

eIF3

eIF4b

80kd

eIF4a

50kd

eIF4c

19kd

eIF5

150kd

释放 eIF2,eIF3 , 与 5’端帽子结合 端帽子结合

eIF4e(eIF4f 的亚基 的亚基) 4.4.3 肽链的延伸

过程: 过程:后续 AA-tRNA 与核糖体结合 肽链的生成

移位

延伸因子: 原核生物) 延伸因子:EF-Tu,EF-Ts,EF-G(原核生物 , , 原核生物 EF-1,EF-2(真核生物 真核生物) 真核生物

2 个 GTP 后续 AA-tRNA 与核糖体结合 细菌中肽链延伸的第一步反应:第二个氨基酰 的结合。该氨基酰-tRNA 首先与 细菌中肽链延伸的第一步反应:第二个氨基酰-tRNA 的结合。该氨基酰 EF-Tu GTP 形成复合物,进入核糖体的 A 位,水解产生 GDP 并在 EF-Ts 的作用下释放 形成复合物, GDP 并使 EF-Tu 结合另一分子 GTP,进入新一轮循环。 ,进入新一轮循环。 肽键的生成 核糖体mRNAAA-tRNA 复合物中,AA-tRNA 占据 A 位,fMet-tRNAfMet 占据 P 位。在肽 核糖体 复合物中, ( 的催化下, A 基转移酶 peptidyl transferase) ) 的催化下, 位上的 AA-tRNA 转移到 P 位, fMet-tRNAfMet 与 上的氨基酸生成肽键。 位点, 上的氨基酸生成肽键。起始 tRNA 在完成使命后离开核糖体 P 位点,A 位点准备接受新的 AA-tRNA,开始下一轮合成反应。 ,开始下一轮合成反应。 移位

肽键延伸过程中最后一步反应是移位, 即核糖体向 mRNA 3' 端方向移动一个密码子。 端方向移动一个密码子。 此时, 肽键延伸过程中最后一步反应是移位, 此时, 去氨基酰-tRNA 被挤入 E 位, 仍与第二个密码子相结合的二肽基 tRNA2 从 A 位进入 P 位,去氨基酰 mRNA 上的第三位密码子则对应于 A 位。EF-G 是移位所必须的蛋白质因子,移位的能量 是移位所必须的蛋白质因子, 水解。 来自另一分子 GTP 水解。 4.4.4 肽链的终止 终止因子: 终止因子:

种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1 用于识别终止密码子 UAA、UAG;RF2 原核生物有 3 种蛋白因子 、 、 。 、 ; 不识别终止密码子,主要是协助肽的释放。 帮助识别 UAA、UAG;RF3 不识别终止密码子,主要是协助肽的释放。一旦 tRNA 从核糖 、 ; 体上脱落, 亚基,核糖体可以重复使用。 体上脱落,则核糖体立即离开 mRNA,并解离成 50S 和 30S 亚基,核糖体可以重复使用。 , 真核生物仅一种: 真核生物仅一种:RF 4.4.5 蛋白质前体的加工

1.N 端 fMet 或 Met 的切除 2.二硫键的形成:蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成 二硫键的形成: 二硫键的形成 3.特定氨基酸的修饰:磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化 特定氨基酸的修饰:磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、 特定氨基酸的修饰 4.切除新生肽链中的非功能片段 切除新生肽链中的非功能片段 糖蛋白中常见的糖—肽连接键: 糖蛋白中常见的糖 肽连接键: 肽连接键

N—糖苷键:β-N-乙酰氨基葡萄糖基 天冬酰胺 糖苷键: 乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰胺 糖苷键 乙酰氨基葡萄糖基 天冬酰胺(GlcNAc-Asn) O—糖苷键:α-N-乙酰氨基半乳糖基 丝氨酸 苏氨酸 糖苷键: 乙酰氨基半乳糖基-丝氨酸 苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr) 糖苷键 乙酰氨基半乳糖基 丝氨酸/苏氨酸 4.4.6 蛋白质合成的抑制剂 1.抗生素类阻断剂: 抗生素类阻断剂: 抗生素类阻断剂 链霉素、卡那霉素、新霉素等: 链霉素、卡那霉素、新霉素等:竞争性抑制蛋白质合成

四环素和土霉素:四环素阻止氨酰 四环素和土霉素:四环素阻止氨酰-tRNA 转移到 A 位置 氯霉素: 氯霉素:阻断 50S 亚基的活性 嘌呤霉素(Puromycin) 嘌呤霉素

白喉霉素(diphtheria toxin):与延长因子发生作用 白喉霉素 : 2.干扰素对病毒蛋白合成的抑制: 干扰素对病毒蛋白合成的抑制: 干扰素对病毒蛋白合成的抑制 干扰素, 干扰素, 干扰素。 从白细胞中得到 α-干扰素,从成纤维细胞中得到 β-干扰素,在免疫细胞中得到 γ-干扰素。 干扰素 干扰素 干扰素

抗生素抑制蛋白质生物合成的原理

抗生素

作用点

作用原理

四环素族

原核核蛋白体小亚基

抑制氨酰抑制氨酰 tRNA 与小亚基结合 抑制转肽酶, 抑制转肽酶,阻断延长

氯霉素

原核核蛋白体大亚基 原核核蛋白体大亚基

链霉素/卡那霉素 链霉素 卡那霉素 原核核蛋白体小亚基

改变构象引起读码错误, 改变构象引起读码错误,

抑制起始 基 抑制转肽酶, 抑制转肽酶,妨碍移位

嘌呤霉素

原、真核核蛋白体大亚

放线菌酮

真核核蛋白体大亚基

抑制转肽酶, 抑制转肽酶,阻断延长

红霉素

原核核糖体大亚基

阻断移位, 阻断移位,阻断 Pro 合成延长

4.4.7 RNA 分子在生物进化中的地位 RNA 在生命起源中的地位及其演化过程 生命是自我复制的体系: 生命是自我复制的体系:

三种生物大分子, 既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此, 三种生物大分子,只有 RNA 既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此,推测 RNA 可能是生命起源中最早的生物大分子。 可能是生命起源中最早的生物大分子。

核酶(ribosome):具有催化作用的 RNA。 : 核酶 。 由 RNA 催化产生了蛋白质 DNA 代替了 RNA 的遗传信息功能 DNA 双链比 RNA 单链稳定; 单链稳定; DNA 链中胸腺嘧啶代替了 RNA 链中的尿嘧啶,使之易于修复。 链中的尿嘧啶,使之易于修复。 蛋白质取代了绝大部分 RNA 酶的功能 蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性; 蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性;

相比,蛋白质能更为有效地催化多种生化反应,并提供更为复杂的细胞结构成分, 与 RNA 相比,蛋白质能更为有效地催化多种生化反应,并提供更为复杂的细胞结构成分, 逐渐演化成今天的细胞。 逐渐演化成今天的细胞。

4.5 蛋白质运转机制 蛋白质运转类别

若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的,则属于翻译运转同步机制; 若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的,则属于翻译运转同步机制;

若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转,则属于翻译后运转机制。 若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转,则属于翻译后运转机制。

这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。 这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。

4.5.1 翻译 运转同步机制 翻译—运转同步机制 信号序列(signal sequence):在起始密码子后,有一段编码疏水性氨基酸序列的 RNA 区域, 区域, 信号序列 :在起始密码子后, 这个氨基酸序列就被称为信号序列。 这个氨基酸序列就被称为信号序列。

信号肽(signal peptide): 信号肽 : 绝大多数越膜蛋白的 N 端都具有长度大约在 13-36 个残基之间的以 端信号序列或称信号肽。 疏水氨基酸为主的 N 端信号序列或称信号肽。 信号肽的结构特点: 信号肽的结构特点:

1.一般带有 10-15 个疏水氨基酸 一般带有 2.常常在靠近该序列 N-端疏水氨基酸区上游带有 1 个或数个带正电荷的氨基酸 常常在靠近该序列 端疏水氨基酸区上游带有 3.在其 C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸,离切割位点最近的那个氨 在其 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸, 基酸往往带有很短的侧链(Ala 或 Gly) 基酸往往带有很短的侧链 信号序列的基本作用: 信号序列的基本作用:

1.通过与 SRP 的识别和结合,引导核糖体与内质网结合 通过与 的识别和结合, 2.通过信号序列的疏水性,引导新生肽跨膜转运 SRP & DP 通过信号序列的疏水性, 通过信号序列的疏水性

信号识别颗粒(signal recognition partical,SRP):是一种核糖核酸蛋白复合体,它的作用是 信号识别颗粒 , :是一种核糖核酸蛋白复合体, 识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上。 识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上。

停靠蛋白(docking protein,DP,又称 SRP 受体蛋白 :即 SRP 在内质网膜上的受体蛋白, 受体蛋白): 在内质网膜上的受体蛋白, 停靠蛋白 , , 牢牢地结合, 它能够与结合有信号序列的 SRP 牢牢地结合,使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上 来。

信号肽假说(signal hypothesis): 信号肽假说 : 提出: 提出:G.Blobel & B.Dobborstein(1975) 证明: 证明:基因重组实验

核心内容:核糖体同内质网的结合受制于 中特定的密码序列(可以翻译成信号肽 可以翻译成信号肽), 核心内容:核糖体同内质网的结合受制于 mRNA 中特定的密码序列 可以翻译成信号肽 , 具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。 具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。

已知野生型细胞中, 半乳糖酶定位于胞质内 麦芽糖结合蛋白定位于胞外, 半乳糖酶定位于胞质内, 已知野生型细胞中,β-半乳糖酶定位于胞质内,麦芽糖结合蛋白定位于胞外,麦芽糖运转蛋 白位于外膜内腔。 白位于外膜内腔。如果把 β-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白 半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白 的氨基端基因片段相连,并以此为模板指导合成杂种蛋白质, 的氨基端基因片段相连,并以此为模板指导合成杂种蛋白质,就可以通过测定 β-半乳糖酶 半乳糖酶 的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。 的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。

4.5.2 翻译后运转机制 1.线粒体蛋白质的跨膜运输 线粒体蛋白质的跨膜运输 2.叶绿体蛋白质的跨膜运输 叶绿体蛋白质的跨膜运输 翻译后运转机制 翻译后运转机制

线粒体蛋白质的跨膜运转

通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。 通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。这个过程有如下特征:①通过线粒体膜的 这个过程有如下特征: 蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在, 蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在,它由成熟蛋白质和 N 端延伸出的一段前导肽 (leader peptide)共同组成。 ②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程;③蛋白质 )共同组成。 蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程;

通过线粒体膜运转时, 通过线粒体膜运转时,首先由外膜上的 Tom 受体复合蛋白识别与 Hsp70 或 MSF 等分子伴 侣相结合的待运转多肽, 组成的膜通道进入线粒体内腔。 侣相结合的待运转多肽,通过 Tom 和 Tim 组成的膜通道进入线粒体内腔。 前导肽的作用与性质

拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体, 这一过程中前导肽被水解, 拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体,在这一过程中前导肽被水解, 前体转变为成熟蛋白,失去继续跨膜能力。 前体转变为成熟蛋白,失去继续跨膜能力。

前导肽一般具有如下特性:带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)含量较为丰富, 前导肽一般具有如下特性:带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)含量较为丰富,它们 分散于不带电荷的氨基酸序列之间;缺少带负电荷的酸性氨基酸;羟基氨基酸( 分散于不带电荷的氨基酸序列之间;缺少带负电荷的酸性氨基酸;羟基氨基酸(特别是丝 氨酸)含量较高;有形成两亲(既有亲水又有疏水部分) 螺旋结构的能力 螺旋结构的能力。 氨酸)含量较高;有形成两亲(既有亲水又有疏水部分)α-螺旋结构的能力。 叶绿体蛋白质的跨膜运转

叶绿体定位信号肽一般有两个部分,第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质, 叶绿体定位信号肽一般有两个部分,第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质,第二部 分决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中,蛋白质运转是在翻译后进行的, 分决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中,蛋白质运转是在翻译后进行的,在运转过 程中没有蛋白质的合成。 程中没有蛋白质的合成。

叶绿体蛋白质运转过程有如下特点: 叶绿体蛋白质运转过程有如下特点: 过程有如下特点

①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内,这是鉴别翻译后运转的指标之一。 活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内,这是鉴别翻译后运转的指标之一。

②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。 叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。

③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。 叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。

4.5.3 核定位蛋白的运转机制 核定位序列( 可以位于核蛋白的任何部位。 核定位序列(NLS—Nuclear Localization Sequence) NLS 可以位于核蛋白的任何部位。 ) 蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子包括核运转因子 (Importin)α、β 和一个低分子量 GTP 酶(Ran)参与。由上述三个蛋白组成的复合物停 ) 、 )参与。由上述三个蛋白组成的复合物停 靠在核孔处, 提供的能量进入细胞核, 亚基解离, 靠在核孔处,依靠 Ran GTP 酶水解 GTP 提供的能量进入细胞核,α 和 β 亚基解离,核蛋 亚基解离, 分别通过核孔复合体回到细胞质中,起始新一轮蛋白质运转。 白与 α 亚基解离,α 和 β 分别通过核孔复合体回到细胞质中,起始新一轮蛋白质运转。

端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、 细菌同样能通过定位于蛋白质 N-端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、外膜、双层膜 端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜 外膜、 之间或细胞外等不同部位。 之间或细胞外等不同部位。

4.5.4 蛋白质的降解 在大肠杆菌中, 的蛋白酶( 在大肠杆菌中,蛋白质的降解是通过一个依赖于 ATP 的蛋白酶(称为 Lon)来实现的。当 )来实现的。 细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时,该酶就被激活。 细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时,该酶就被激活。Lon 蛋白酶每切除一 个肽键要消耗两个分子的 ATP。 。 端的第一个氨基酸 端甲硫氨酸之外, 但包括翻译后修饰产物) 成熟蛋白 N-端的第一个氨基酸 除已被切除的 N 端甲硫氨酸之外, 端的第 ( 但包括翻译后修饰产物) 在蛋白的降解中有着举足轻重的影响( )。当某个蛋白质的 端是甲硫氨酸、 在蛋白的降解中有着举足轻重的影响(表 4-16)。当某个蛋白质的 N 端是甲硫氨酸、甘氨 )。 端为赖氨酸、精氨酸时, 酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时,表现稳定。其 N 端为赖氨酸、精氨酸时,表现 丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时,表现稳定。 最不稳定, 分钟就被降解了。 最不稳定,平均 2-3 分钟就被降解了。 在真核生物中,蛋白质的降解依赖于泛蛋白( ),该蛋白只有 个氨基酸残基, 在真核生物中,蛋白质的降解依赖于泛蛋白(Ubiquitin),该蛋白只有 76 个氨基酸残基, ), 序列高度保守(从酵母和人细胞中提取的泛蛋白几乎完全相同!),生物细胞内即将被降 序列高度保守(从酵母和人细胞中提取的泛蛋白几乎完全相同!),生物细胞内即将被降 !), 的作用下与泛蛋白相连。 解的蛋白首先在 ATP 的作用下与泛蛋白相连。这个过程需有 E1、E2、E3 三个降解因子参 、 、 三个降解因子参 与。一旦被降解蛋白与泛蛋白相连接,这个复合体就能被运送到分子量高达 1×106 的蛋白 一旦被降解蛋白与泛蛋白相连接, 降解体系中直到完全降解。 降解体系中直到完全降解。

习题

1.遗传密码的摆动性是指 遗传密码的摆动性是指: 遗传密码的摆动性是指 A.遗传密码可以互换 遗传密码可以互换 补 B.密码的第 3 位碱基与反密码的第 1 位碱基可以不严格互 密码的第

C.一种密码可以代表不同的氨基酸 一种密码可以代表不同的氨基酸 E.不同的氨基酸具有相同密码 不同的氨基酸具有相同密码

D.密码与反密码可任意配对 密码与反密码可任意配对

2.反密码子 IGC 可以识别的密码子是 反密码子 可以识别的密码子是:

A.GCG

B.GCA

C.ACG D.ICG

3.关于 tRNA 的叙述 下列哪项是错误的 关于 的叙述,下列哪项是错误的: 下列哪项是错误的

A.有反密码子 能识别 mRNA 分子的密码 B.由氨基酸臂携带氨基酸 有反密码子,能识别 有反密码子 由氨基酸臂携带氨基酸 C.一种 tRNA 能携带多种氨基酸 一种 载 D.一种氨基酸可由数种特定的 tRNA 运 一种氨基酸可由数种特定的

E.20 种氨基酸都各有其特定的 tRNA

4.真核生物的翻译起始复合物在何处形成 真核生物的翻译起始复合物在何处形成? 真核生物的翻译起始复合物在何处形成 A.起始密码子 AUG 处 起始密码子 B.5’末端的帽子结构 末端的帽子结构 C.TATA 框 D.CAAT 框

5.合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是 合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是: 合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是 A.脯氨酸 脯氨酸 B.羟脯氨酸 羟脯氨酸 C.丝氨酸 丝氨酸 D.赖氨酸 赖氨酸

6.下列哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质生物合成 下列哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质生物合成? 下列哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质生物合成 A.环己酰亚胺 放线菌酮 环己酰亚胺(放线菌酮 环己酰亚胺 放线菌酮) E.嘌呤霉素 嘌呤霉素 7.细胞合成的分泌蛋白质在 N 端都有一段信号肽 这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基 细胞合成的分泌蛋白质在 端都有一段信号肽,这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基 这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基: A.大于 100 大于 B.15 到 30 C.约 50 约 D.小于 10 小于 B.氯霉素 氯霉素 C.四环素 D.链霉素 四环素 链霉素

8.信号识别颗粒 信号识别颗粒(signal recognition particle)的作用是 的作用是: 信号识别颗粒 的作用是 A.指导 RNA 剪切 指导 B.引导分泌蛋白质跨膜 引导分泌蛋白质跨膜 D.直到转录终止 直到转录终止

C.指引核糖体大小亚基结合 指引核糖体大小亚基结合 5 分子生物学研究法

现代分子生物学研究方法, 特别是基因操作和基因工程技术的进步使得分子生物学研究在上 个世纪中叶开始高速发展。 5.1 重组 DNA 技术发展史上的重大事件 上世纪分子生物学研究取得的三大成就:

第一,在 20 世纪 40 年代确定了遗传信息的携带者:即基因的分子载体是 DNA 而不是蛋白 质,解决了遗传的物质基础问题; 第二,50 年代提出了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复 制和世代交替问题; 第三,50 年代末至 60 年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密 码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。 1.DNA 是遗传物质的实验 40 年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是 DNA 而不是蛋白质,解决了遗传的 物质基础问题; Hershey 和 Chase(1952)的噬菌体侵染细菌实验 2. 50 年代揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和 世代交替问题; 3. 50 年代末至 60 年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分 认识了遗传信息的流动和表达。 但是: 当时由于缺乏有效的分离和富集单一 DNA 分子的技术,科学家无法对这类物质进行直接的 生化分析。随着 DNA 分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重 组 DNA 技术的产生与发展。 重组 DNA 技术(recombination) " 重组 DNA 技术:

是应用酶学方法,在体外将不同来源的 DNA 分子通过酶切、连接等操作重新组装成 杂合分子,并使之在适当的宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代 DNA 分子的过程。 " 工具酶: 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) DNA 连接酶(DNA ligase) 工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件 两大技术保证:

1.DNA 的体外切割和连接 重组 DNA 实验中常见的主要工具酶

酶 功

类 能

限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开 DNA DNA 连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个 DNA 片段连接成一个 DNA 分子 DNA 聚合酶 I(大肠杆菌) 按 5'到 3'方向加入新的核苷酸,补平 DNA 双链中的缺口 反转录酶 按照 RNA 分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合成 DNA 链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的 5'-OH 末端(进行末端标记实验或用来进行 DNA 的连接 末端转移酶 在双链核酸的 3'末端加上多聚单核苷酸 DNA 外切酶 III 从 DNA 链的 3'末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体 DNA 外切酶 从 DNA 链的 5'末端逐个切除单核苷酸

碱性磷酸酯酶 切除位于 DNA 链 5'或 3'末端的磷酸基团

2.DNA 的核苷酸序列分析技术 DNA 核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的 DNA 技术学,这门技术,对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系,以及克隆 DNA 片断的操作方面,都有着十分广泛的使用价值。 重组 DNA 实验中常见的主要工具酶

分子生物学研究的核心技术 基因操作(gene manipulation) : DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分 析以及基因的人工合成、定点突变和 PCR 扩增等。 基因工程(gene engineering) : 是指在体外将核酸分子接入病毒、 质粒或其它载体分子, 构成遗传物质的新组 合,并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内而能持续的繁殖。 5.2 DNA 操作技术 5.2.1 核酸的凝胶电泳 v 电泳的基本原理: 一种带电粒子在电场中,会以一定的速度移向与它自身带相反电荷的电极。我们把 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度, 叫做电泳的迁移率, 它与电场强度和电泳分子本身 所携带的净电荷数成正比。 v 核酸的凝胶电泳: 糖-磷酸骨架在结构上的重复性质, 相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净负电荷, 因 此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA 分子的这种迁移速 度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。 v 影响迁移率的四大因素:

一、分子物理性质: 分子大小:大的迁移快 电荷多少:电荷密度大的迁移快 构形:闭环(CCC)>单链开环(OC) >线性(L) 二、支持介质: 在电泳中常用无反应活性的稳定的支持介质, 如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等, 其分子的迁移 率与分子的摩擦系数成反比。其中,摩擦系数与凝胶密度相关。 三、电场强度: 电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。在低电压时,线状 DNA 片段的迁移率与所用电压成正比。但当电压增高时,大分子量 DNA 片段迁移率的增大是不 同的,因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。电场强度愈大,带电颗粒的泳动 速度愈快。 四、缓冲液离子强度: 缓冲液是电泳场中的导体,它的种类、pH 值、离子浓度直接影响电泳的效率。常用的缓冲 体系有 Tris-醋酸(TAE) Tris-硼酸( TBE ) Tris-磷酸( TPE )三种。以 TAE 最为常 、 、 用,价格低且其缓冲能力低,需经常更新 脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,简称 PFGE): 用于分离超大分子量(有时甚至是整条染色体)DNA。 在标准的 PFGE 中,第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成 45°夹角,而第二个脉冲的 电场方向与核酸移动方向在另一侧成 45°夹角 。 应用脉冲电场凝胶电泳技术,可成功地分离到分子量高达 107bp 的 DNA 大分子。 核酸电泳的指示剂: 电泳过程中, 常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。 核酸电泳常用的指示剂有 两种:溴酚蓝呈蓝紫色,二甲苯青呈蓝色。 溴酚蓝的分子量为 670Da,在不同浓度凝胶中,迁移速度基本相同,它的分子筛效应小,近 似于自由电泳,故被普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为 554.6Da,携带的电荷量比溴酚 蓝少,在凝胶电泳中,迁移率比溴酚蓝慢。

核酸电泳的染色剂: 溴化乙锭(EB)是一种具扁平分子的核酸染料,能插入到 DNA 或 RNA 分子的相邻碱基之 间,并在 300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。 溴化乙锭不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合。 在适当的染色条件下(0.5 ug/ml) ,荧光强度与 DNA 片段的大小(或数量)成正比。 5.2.2 核酸的分子杂交 定义: 核酸杂交(Nucleic acid hybridization) :是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下, 按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。 原理: DNA 的变性和复性 在一定的条件(如适当的温度、有机溶剂存在等)下,DNA 的双链可解开成为单链,这一 过程称为 DNA 的变性(Denaturation) 。高温、低盐和有机溶剂促进 DNA 变性。 DNA 的杂交即复性(Renaturation)是变性的单链 DNA 在一定的条件下(低于 Tm 的温度 下)与其互补序列退火形成双链的过程,因此杂交与 Tm 值相关。 影响杂交的主要因素: 温度:一般在低于 Tm 约 15 至 25 度的温度下杂交速率最快。 盐浓度:钠离子增加杂交分子的稳定性,降低钠离子浓度强烈地影响 Tm 值和复性速率。但 当钠离子浓度超过 0.4M 时,对复性速度和 Tm 值影响不大。 甲酰胺:有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加 1%的甲酰胺,DNA/DNA 或 DNA/RNA 双链的 Tm 值减少 0.72℃。常用 50%甲酰胺。 硫酸葡聚糖:使杂交速率增加,但有时可能增加杂交本底。 核酸探针的类型 1 2 克隆的 DNA 片段,常用 cDNA 探针。 RNA 探针(Riboprobe)

RNA 探针的优点是特异性高;杂交效率(灵敏度)更高。适合于 Northen 杂交、原位杂交等。 主要缺点是不稳定,易被降解,另外其制备较困难。 3 寡核苷酸探针

可用化学方法人工合成,制备较方便,但灵敏度稍差。 4 聚合酶链反应扩增产物

是很好的探针来源,其优点是制备和标记相对容易。 核酸标记的类型: 放射性同位素:32P, 35S , 33P 目前应用最广,优点是灵敏度高,特别适用于单拷贝基因或低丰度 mRNA 检测,缺点是易 造成放射性污染以及半衰期短,使用不便。 非同位素标记: 常用地高辛或生物素系统。 优点:无放射性污染,较稳定;缺点:灵敏度、特异性稍差。 常用核酸杂交技术 滤膜杂交 固相杂交

原位杂交 核酸杂交

液相杂交 滤膜杂交: 是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上, 然后与存在于 溶液中的已标记探针进行杂交的过程。 滤膜杂交的基本过程

1. 2. 3. 4. 5. 6.

核酸探针的制备和标记; 核酸片段的凝胶电泳分离; 将凝胶中的核酸片段通过印迹(blot)转移到某种固相支持物上; 用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交; 洗膜(除去未杂交的游离探针等) ; 检测带标记的杂交分子(放射自显影或酶联反应) 。

常见的几种滤膜杂交 1. 程。 Southern 印迹:指将经过电泳分离的 DNA 片断转移到一定的固相支持物的过

根据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上,然 后通过同标记的单链 DNA 或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA 片段, 这种实验 方法叫做 DNA 印迹杂交技术。 Southern 印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组 DNA 的定性和定量分析以及利用限制 性片段长度多态性进行基因突变分析等。

2. Northern 印迹:是指 RNA 经变性凝胶电泳后,将其转移到固相支持物上,以 便用杂交反应检测特定的 mRNA 分子的含量与大小。 基本过程包括: RNA 的提取 RNA 变性电泳 RNA 转移和固定 杂交 检测 除 RNA 的提取和变性胶电泳与 DNA 不同外,其余基本与 Southern 印迹 同,关键是减少 实验中的 RNA 酶污染。 Northern blotting(诺赛恩 RNA 印迹技术) 是将 RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸 杂交的一种实验方法。

3 蛋白质杂交技术(Western blotting) :又称为 immunoblotting,指将蛋白质从电泳凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上,然后同放射性同位素 125I 标记的特定蛋白质之抗体进行反应的 技术。 基因探针(probe):就是一段与目的基因或 DNA 互补的特异核苷酸序列,它可以包括整个基 因,也可以仅仅是基因的一部分,可以是 DNA 本身,也可以是由之转录而来的 RNA 探针的种类:基因组探针(genomic probe);cDNA 探针(cDNA probe);寡核苷酸探针(人工合 成的)。 探针的标记:放射性同位素:如 32P;非同位素:如生物素、地高辛。 理想标记物特点 一种理想的标记物,应具备以下几种特性:①高度灵敏性;②标记物与核酸探分子的结合, 应绝对不能影响其碱基配对特异性; ③应不影响探针分子的主要理化特性、 杂交特异性和杂 交稳定性,杂交体的 Tm 应无较大的改变;④检测方法具有高度特异性。 1、放射性同位素:灵敏度和特异性高、应用广泛;易造成放射性污染、半衰期短。32P、 3H 和 35S 2、非放射性同位素:无放射性污染,稳定性好;灵敏度和特异性不太高。半抗原、配体结 合生物素、地高辛和荧光素。 Probe synthesis Nick Translation 切口平移法 Random Priming 随机引物合成法 End labeling 末端标记法 5.2.3 细菌转化 细菌转化: 是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的 DNA 而导致性状特征发生遗传改变的 生命过程。提供转化 DNA 的菌株叫作供体菌株,接受转化 DNA 的细菌菌株则被称为受体 菌株。 感受态细胞: 处于能够接受外源 DNA 状态的细胞称为。

步 骤: 1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞 膨胀(形成原生质球) 。 2.与转化混合物中的外源 DNA 形成粘附在细胞表面的复合物。 3.立即将该体系转移到 42℃下做短暂的热刺激,复合物便会被细胞所吸收。 4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。 5.2.4 核苷酸序列分析 1968 年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略 Sanger 在它的基础之上发展了快速测定 DNA 的末端终止法 K Mullis 完善了 PCR 扩增 DNA 方法 1、Sanger 双脱氧链终止法 这种方法要求使用一种单链 DNA 模板和一种适当的 DNA 引物,因此有时也称为引物合成 法或酶催引物合成法。 由于 ddTTP 没有 3'-OH 基团, 寡核苷酸链不再继续延长, 在本该由 dTTP 掺入的位置上发生 了特异性的链终止效应。 2、Maxam-Gilbert 化学修饰法 用化学试剂处理末端带有放射性标记的 DNA 片段,造成碱基的特异性切割,由此产生的一 组具有各种不同长度的 DNA 片段的反应混合物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,便可 根据 X 光片底板上所显现的相应谱带,直接读出待测 DNA 片段的核苷酸顺序。 Gilbert & Maxam 的化学修饰法 G 系统: pH 8.0

硫酸二甲酯 → G → m7G →C8~C9 断裂 →脱 G A+G 系统:pH 2.0

哌啶甲酸(pidine)→ 嘌呤环 N 质子化→ 脱嘌呤 C 系统: 1.5 mol/L NaCl

C + 肼(hydrazine)→ 脱 C T + C 系统: 肼(hydrazine) → 打开嘧啶环 →重新 5C 环化→脱嘧啶 3. DNA 序列测定的自动化 1. DNA 测序步骤与自动化 1)模板制备 2)定序反应 3)凝胶电泳 可自动化 可自动化 自动化有一定困难:制胶,点样,电泳,凝胶干燥,放射自显影。 可自动化

4)核苷酸序列阅读与计算机输入 2.自动测序仪

Conney 等人于 1987 年设计了不同荧光染料标记引物, 然后做链终止测序, 用激光扫描阅读序列。 红色引物+T 反应系统(引物+DNA+dNTP+ddTTP) 黄色引物+G 反应系统(引物+DNA+dNTP+ddGTP) 绿色引物+A 反应系统(引物+DNA+dNTP+ddATP) 兰色引物+C 反应系统(引物+DNA+dNTP+ddCTP) 3、DNA 序列分析的自动化 采用四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)作为荧光剂,预先标记引物 DNA。带有这种引 物的 DNA 片段能在激光诱导下发出荧光。 电泳过程中,当 DNA 条带在电场的作用下,经过激光通道小孔时,带有荧光剂标记的 DNA 在激光的激发下便产生了荧光。 4、DNA 杂交测序法(SBH)

利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针,同某一特定的较长的靶 DNA 分子进行杂交, 从而测定其核苷酸的序列。 5.2.5 基因扩增(PCR) PCR 的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 (一)PCR 的基本过程 1. 2. 变性(Denaturation) :待扩增的 DNA 模板加热变性成单链; 退火(Annealing) :降低温度,使单链靶序列与寡核苷酸引物退火;

3. 延伸(Extension) :在适当条件下,利用 DNA 聚合酶使引物延伸,产生新的双 链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环,导致特异的靶序列的指数扩增。 " PCR 产物是介于引物的 5’端之间的双链 DNA 片段。

PCR 反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由 DNA 变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。 图中设定的反应参数是 94℃变性 1min, 60 ℃退火 1min, 72 ℃延伸 1.5min。如此周而复 始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 (二)PCR 体系中的主要成份 1. Taq DNA 聚合酶

" 它是一种耐热的 DNA 聚合酶,具有 5’-3’DNA 聚合酶活性,一般有 5’-3 外切酶活性, 有或无 3’-5’外切酶活性(校对活性) ,无校对活性的酶在 PCR 中错掺率较高。 2. 寡核苷酸引物

" 它是决定 PCR 扩增特异性的关键。PCR 中所用引物浓度一般在 0.1-0.5uM 太高的引物浓 度易造成非特异性扩增,太低会降低合成效率。 3. MgCl2

– Mg2+浓度除影响 Taq 酶活性外,还影响双链 DNA 的 Tm 值,因而影响 PCR 的特异 性和扩增效率。

– PCR 中的最适 MgCl2 浓度一般为 1.5-2.5mM(注意游离 Mg2+浓度还与能结合 Mg2+ 的化合物如 dNTP、EDTA 等的浓度有关。 4. 脱氧核苷三磷酸(dNTP)

– 一般采用均衡的 dNTP 浓度, 种 dNTP 各为 200umol/L,dNTP 可减少游离 Mg2+ , 4 因此影响聚合酶活性和引物退火。 5. – 模板 单、双链 DNA,以及 RNA 经逆转录合成的 cDNA。

PCR 技术的研究应用 1、基因组克隆 2、反向 PCR 与染色体步移 3、RT-PCR 与 RNA 分析 4、基因的体外诱变与突变的检测 5、基因组的比较研究(RAPD) 5.2.6 DNA 与蛋白质相互作用研究 5.2.6.1. 凝胶阻滞试验 凝胶阻滞试验(gel retardation assay) ,又叫作 DNA 迁移率变动试验(DNA mobility shift assay) ,是用于体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 载体 指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类 DNA 分子称为载体。载体是基因克 隆中外源 DNA 片段的重要运载工具。 载体必须具备的条件: ① 复制起点:是一段具有特殊结构的 DNA 序列,载体有复制起点才能使其及与其结合的 外源基因在适当的宿主细胞中复制繁殖。 ② 有一个或多个筛选标记,如抗药性、显色表型反应等以区别阳性和阴性重组子。

③多克隆位点:多种限制性内切酶的单一识别位点,便于外源基因的插入。 ④ 适当的拷贝数。一般而言,较高的拷贝数不仅利于载体的制备,同时还会使细胞中克隆 基因的剂量增加。 ⑤ 载体分子量不宜过大,以便于 DNA 体外操作,同时载体 DNA 与宿主核酸应易于分离, 便于提纯。 ⑥ 对于表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等 DNA 调控信号。 载体的类型: 质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体等。 质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链 DNA 分子,能自主复制,并在细胞分裂时遗 传给子代细胞。 质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状, 如抗药性等, 通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存 在,这是筛选重组转化子的基础。 基因组文库与 cDNA 文库的构建 一 基因组文库的构建

二 cDNA 文库的构建 Ⅰ 真核基因组文库

" 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA 克隆群体,构建基因 组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA 克隆群体 " 常用的构建真核生物细胞基因组文库的载体是λ噬菌体和粘性质粒。

构建基因组文库的步骤 1、载体的制备 2、基因组 DNA 的制备 3、载体与基因组 DNA 的连接

4、体外包装提取物的制备和重组 DNA 的体外包装 5、重组噬菌体滴度的检测、扩增与保存基因组文库 Ⅱ cDNA 文库的构建 " cDNA 文库:真核生物 mRNA 逆转录所形成的 DNA 称为 cDNA。将 cDNA 与载体 DNA 重组,并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒,得到一系列克隆群体。这样的克隆 群体叫做 cDNA 文库。 " cDNA 文库可直接进行筛选目的基因,由于 cDNA 中不含内含子,因此所筛选的基因 可以直接表达。 构建 cDNA 文库主要包括以下几个步骤: 1、 mRNA 的分离 2、cDNA 第一链的合成 3、cDNA 第二链的合成 4、cDNA 与载体的连接: 5、噬菌体的包装、转染和质粒 DNA 的转化 " 如果用质粒 DNA 做载体,cDNA 与载体连接后可直接转染宿主细胞,建立 cDNA 文 库。如采用噬菌体为载体,必需经过体外包装,形成噬菌体颗粒,感染宿主菌。 RNA 提取 将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总 RNA 共温育, 加入与微磁球相连的抗生物素蛋白, 用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的 mRNA。 5.4 基因的分离与鉴定 基因克隆(gene cloning): 又称为重组 DNA 技术, 是应用酶学方法, 在体外将不同来源的 DNA 分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子,并使之在适当的宿主细胞中进行扩增,形 成大量的子代 DNA 分子的过程。 基本步骤: (1) 用于基因克隆的 DNA 材料的选择以及 DNA 分子的片段化; (2) 外源 DNA 片段与载体分子的体外连接反应; (3) 将人工重组的 DNA 分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞;

(4) 重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。 5.4.4 克隆基因的分离 1、 应用核酸探针分离克隆目的基因 2、应用 mRNA 差别显示技术分离克隆目的基因 3、应用 cDNA 差示分析法克隆基因 4、应用酵母双杂交体系克隆基因 5、基因的图位克隆法 6、DNA 微列阵技术进行基因克隆 1. 应用核酸探针分离克隆目的基因 把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬 菌斑杂交,以便筛选出具有目的基因的阳性克隆,这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。 应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。 此法应用广泛、有效,适用于大规模筛选。 2. 应用 mRNA 差别显示技术分离克隆目的基因

看家基因(house-keeping gene) ,以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动; 发育调控基因(developmental regulated gene) ,以其时空特异性表达模式完成个体的正常生 长、发育与分化,我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段,或是在不同的组织或细胞中 发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达(differential expression) 。 DDRT-PCR 的主要操作步骤如下: (1)从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离 mRNA,并以 3‘锚定引物作为反转 录的引物,合成第一链 cDNA; (2)用 5'随机引物和某个 3'端锚定引物对扩增第一链(掺入 32P-dNTP); (3)用 DNA 变性测序胶分离扩增产物,X 光片曝光后检测差别条带; (4)回收特异性差别条带; (5)用同一引物对扩增已回收的 DNA 条带; (6)用 Northern,Southern 及测序法分析所得的条带; (7)以该 DNA 片段做探针,筛选全长 cDNA 或核基因。

基因的图位克隆法(Map-based cloning) 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先,通过构建遗传连锁图,将目 的基因定位到某个染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的 RFLP 或 RAPD 分子标 记。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析,找出与目的基因距离最 近的 RFLP 标记,通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。 根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在 RFLP 作图中,连锁距离是根据重组率来计算的, 1cm (厘摩) 相当于 1%的重组率。 人类基因组中, 1cm≈1000kb;拟南芥菜中, 1cm≈290kb; 小麦中,1cm≈3500kb。 本章重点 基因组文库和 cDNA 文库构建过程及应用 PCR 技术原理及应用 分子生物学中常用载体的特征 核酸杂交原理(Southern Blotting, Northern Blotting, 菌落杂交等) 探针制备方法 DNA 与蛋白质相互作用的研究方法 Sanger DNA 测序原理 基因分离方法 影响电泳迁移率的因素 重要概念 基因差别表达、基因克隆、cDNA 文库、基因工程、基因探针、转化、质粒 基因表达的调控 本章内容简介 一、基因表达调控的基本概念与原理 二、乳糖操纵子的调控模式

三、色氨酸操纵子的调控模式 一、基因表达调控的基本概念与原理 1.基本概念: 基因表达(gene expression) :从 DNA 到蛋白质的过程称为基因表达,基因表达的实质就是 遗传信息的转录和翻译。 基因表达的调控(gene regulation or gene control) :对基因表达过程的调节就称为基因表达调 控。 2.基因表达的时间性及空间性 基因表达的时间特异性(temporal specificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序 发生,以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。 基因表达的空间特异性(spatial specificity)是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段, 同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同, 从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞 或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。 3.基因表达的方式 组成性基因表达(constitutive gene expression)是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细 胞中持续进行的基因表达。 其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的, 且较少 受环境因素的影响。这类基因通常被称为管家基因(housekeeping gene) 。 诱导表达(induction)是指在特定环境因素刺激下,基因被激活,从而使基因的表达产物增 加。这类基因称为可诱导基因。 阻遏表达(repression)是指在特定环境因素刺激下,基因被抑制,从而使基因的表达产物 减少。这类基因称为可阻遏基因。 基因表达的生物学意义 (一)适应环境、维持生长和增殖。 (二)维持个体发育与分化。 4. 基因表达调控主要表现方面 4.1 转录水平上的调控(transcriptional regulation)

4.2 转录水平后的调控(post-transcriptional regulation) 1)mRNA 加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript) 2)翻译水平上的调控(differential translation of mRNA) 原核生物基因表达的调控主要发生在转录水平 真核生物基因表达的调控可发生在基因表达的各个水平 4.3 其它影响因素 原核生物中,营养状况(nutritional status)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举 足轻重的影响。 在真核生物尤其是高等真核生物中, 激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage) 是基因表达调控的最主要手段,营养和环境因素的影响力大为下降。 5.基因转录激活调节基本要素: 5.1 顺式作用元件: 顺式作用元件(cis-acting element)又称分子内作用元件,指存在于 DNA 分子上的一些与基 因转录调控有关的特殊顺序。 在原核生物中, 大多数基因表达通过操纵子模型进行调控, 其顺式作用元件主要由启动基因、 操纵基因和调节基因组成。 在真核生物中,与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子(promoter) 、增强子 (enhancer)和沉默子(silencer) 。 5.2 反式作用因子: 反式作用因子(trans-acting factor)又称为分子间作用因子,指一些与基因表达调控有关的 蛋白质因子。 原核生物中的反式作用因子主要分为特异因子、 激活蛋白和阻遏蛋白; 而真核生物中的反式 作用因子通常称为转录因子。 5.3 顺式作用元件与反式作用因子的相互作用: 大多数调节蛋白在与 DNA 结合之前, 需先通过蛋白质-蛋白质相互作用, 形成二聚体或多聚 体,然后再通过识别特定的顺式作用元件,而与 DNA 分子结合。这种结合通常是非共价键 结合。

Ⅰ原核生物转录水平的调控 1 2 3 4 操纵子 弱化子 (衰减子) 降解物 应急反应

Ⅱ原核生物的转录后调控 1. 操纵子的调控模式 1.1 基本概述 1.2 乳糖操纵子的调控模式 1.3 色氨酸操纵子的调控模式 1.4 其他操纵子的调控机制 1.1 操纵子概述 提出:法国 Jacob 与 Monod(1961 年) 概念 操纵子(operon) 指的是一组功能上相关的基因,它是由启动区(promoter) : 、操纵区 (operator)和结构基因(structuralgene)三部分组成。 所谓的操纵子理论是认为在 DNA 分子上分布有调节基因、启动子、操纵区和一群功能相关 的结构基因区。 乳糖操纵元 典型的操纵子可分为控制区和信息区两部分。 控制区由各种调控基因所组成, 而信息区则由 若干结构基因串联在一起构成。 概念 结构基因(structural gene):编码蛋白质的基因。

操纵区(operator):是指能被调控蛋白特异性结合的一段 DNA 序列,常与启动子邻近或与 启动子序列重叠,当调控蛋白结合在操纵子序列上,会影响其下游基因转录的强弱。 调控基因(regulatory gene) :是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。 与 操 纵 子 结 合 后 能 减 弱 或 阻 止 其 调 控 基 因 转 录 的 调 控 蛋 白 称 为 阻 遏 蛋 白 ( repressive protein) ,其介导的调控方式称为负性调控(negative regulation) ; 与操纵子结合后能增强或启动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白 (activating protein) , 所介导的调控方式称为正性调控(positive regulation) 。 1.2 乳糖操纵子的调控模式 乳糖操纵子(lactose operon)的组成 lac 体系受调控的证据 乳糖操纵子的调控 乳糖对 lac 体系的影响 葡萄糖对 lac 体系的影响 CAP & cAMP lac 体系受调控的证据 乳糖添加实验 同位素示踪 乳糖操纵子的本底水平表达 在非诱导状态下有少量的 lac mRNA 合成(大约每个世代中有 1~5 个 mRNA 分子) ,这种 合成被称之为本底水平的永久型合成(background level constitutive synthesis) 。由于阻遏物 的结合并不是绝对紧密的,即使在它与操纵基因紧密结合时,也会偶尔掉下来;这时启动子 的障碍被解除,RNA 聚合酶开始转录。 乳糖操纵子的调控 乳糖操纵子的阻遏: B. 葡萄糖对 lac 操纵子的影响

C. CAP 与 CAP 结合位点 CAP 的通用名称:分解代谢基因激活蛋白(catabolic gene activator protein) 含有 CAP 结合位点的操纵子:乳糖操纵元(lac operon) 、阿拉伯糖操纵元(ara operon) 、半 乳糖操纵元(gal operon) (见课本 206 页) CAP 也起类似的正性调控作用。 lac 操纵子 DNA 的调控区域(P、O 区) 氨基酸合成的操纵子

1.3 色氨酸操纵子(tryptophane operon)的调控模式 属于一种负性调控的、 可阻遏的操纵子 (repressible operon) 即这操纵子通常是开放转录的, , 有效应物(色氨酸为阻遏剂)作用时则阻遏关闭转录。 不受葡萄糖或 cAMP-CAP 的调控。 1.3 色氨酸操纵子的调控模式 A trp 操纵子的组成 B trp 操纵子的阻遏系统

C 衰减子及其作用 D 前导肽 E trp 操纵子的弱化机制

trp 操纵子的阻遏系统 衰减子及其作用 弱化作用(attenuation):当色氨酸达到一定浓度、但还没有高到能够活化 R 使其起阻遏作用 的程度时, 产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低, 而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。 先 导序 列起到 随色 氨酸浓 度升 高降低 转录的 作用 ,这 段序列 就称为 衰减 子或 弱化子 (attenuator) 。

在 trp 操纵元中,对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用,而衰减子起到细调 的作用。 前导肽 见课本 213 页 色氨酸浓度低 ——trp 操纵元就处于开放状态 色氨酸浓度增高 ——转录减弱 Trp 操纵子小结 1.4 其它操纵子的调控机制 半乳糖操纵子(galactose operon) 阿拉伯糖操纵子(arabinose operon) 半乳糖操纵子(galactose operon) 包括 3 个结构基因: 异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE) 半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT), 半乳糖激酶(galactose kinase, galk) 特点: 有两个启动子,其 mRNA 可从两个不同的起始点开始转录 有两个 O 区,一个在 P 区上游-67--53,另一个在结构基因 galE 内部 阿拉伯糖操纵子(arabinose operon) 阿拉伯糖操纵子(arabinose operon),在葡萄糖馈乏时,它能利用阿拉伯糖作为能源。 阿拉伯糖操纵子由 araB,araA 及 araD 基因组成。

II.转录后调控 (见课本) 翻译起始的调控 稀有密码子对翻译的影响 重叠基因对翻译的影响 RNA 高级结构对翻译的影响 魔斑核苷酸水平对翻译的影响 本章掌握重点内容 基因表达调控的概念、特点和基本原理。 乳糖操纵子的结构及其组遏蛋白的负性调控和 CAP 正性调控机理。 色氨酸操纵子的转录衰减机制。 基本概念: 基因表达 激活蛋白 组遏蛋白 顺式作用元件 反式作用因子 操纵基因 衰减子 选择题: 1. Lac 操纵子的诱导剂是 B A.葡萄糖 B.别乳糖 C.阿拉伯糖 O.丝氨酸 E.色氨酸

. Ara 操纵子的诱导剂是

2 就当前认识,基因表达调控最主要的环节是: A、DNA 复制 B、RNA 转录激活 C、RNA 转录后加工

D、RNA 转录后转运 E 、翻译及翻译后加工 (北京医科大学 1999 年生化)

3.对自身基因进行转录调控的特异 DNA 序列是 A.顺式作用因子 C.顺式作用元件 B.反式作用因子 D.反式作用元件

4.由某一基因表达后,对另一基因进行转录调控的因子是

3.如果操纵子的基因突变缺失 A、操纵子将不被转录 B、操纵子将继续被转录

C、操纵子的阻遏蛋白将继续合成 D、将无诱导物 E、以上都不是 是非题 调节基因一般都位于 operon 附近,这种构造有利于调节基因对 operon 的控制. () (中科院上海生化所 2001) 填空题: 操纵子包括_______,__________和__________. (北师大 1999) 选择题 分解代谢基因活化蛋白(CAP)对乳糖操纵子表达是 A 正性调控 D 无调控作用 简答题: 简述乳糖操纵子的正、负调控 (2002 年中国农科院) 什么是正调控与负调控,试举例说明。 (1996 年中国农科院) 以乳糖操纵子为例说明什么是基因的表达与阻遏?(8 分)(1997 第四军医大学) B 正、负性调控 C 负性调控

E 可有可无 (1995 年北医试题)

选择题 下列哪个操纵元中没有衰减子序列? A trp 操纵元 B lac 操纵元 C his 操纵元 D thr 操纵元 是非题: 细菌中衰减子的作用方式是用翻译的手段来控制转录. () 思考: 细菌的 Trp 操纵子中为什么除需要阻遏体系外还需要弱化子系统?

真核基因表达的调控 本章内容简介 I. 真核生物基因表达的调节特点 1 2 3 4 真核基因表达调控的环节更多 真核基因的转录与染色质的结构变化相关 真核基因表达以正性调控为主 其它调控特点:如个体发育复杂;受环境影响较小

2.染色质结构影响基因转录 结论:紧密的染色质结构阻止基因表达 3.真核基因表达以正性调控为主 多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的, 需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转

录。换言之:真核基因表达以正性调控为主导。 II. 真核基因表达调控的层次 1 DNA 和染色体水平上的调控 2 3 4 5 转录水平上 转录后 RNA 加工过程和运送中的调控 翻译水平 翻译后的控制

1. DNA 和染色体水平上的调控 1.1 基因拷贝数的扩增或丢失和基因重排 1.2 DNA 在染色体的位置(常染色质、异染色质) 1.3 染色质结构的变化(活化) 1.4 DNA 的碱基修饰 基因扩增 基因扩增 (gene amplification) : 即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。 例如:蛙成熟卵细胞在受精后的发育程中其 rRNA 基因(可称为 rDNA)的扩增 基因扩增的调控机理至今还不清楚 基因扩增的意义 基因的扩增能够大幅度提高基因表达产物的量, 适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量 蛋白质要求有大量核糖体的需要。 基因丢失 有的生物在个体发育的早期在体细胞中要丢失部分染色体, 而在生殖细胞中保持全部的基因 组, 被丢失的染色体其上的遗传信息可能对体细胞来说没有什么意义, 而对生殖细胞的发育 也许是不可缺少的。 例如:马蛔虫(Parascaris equoorum)和小表瘿蚊(Mayetiole destructor)的生殖细胞的形成。

基因重排 基因重排(gene rearrangement) :即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。 例如:免疫球蛋白的基因 基因重排的的生物学意义 这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段, 组合变化而产生能编码达 108 种不同 抗体的基因,提高对外界环境的适应性。 1.3 染色质的结构变化(染色质的活化 ) 1 2 组蛋白的作用 转录活跃区域对核酸酶敏感度增加

3 DNA 拓扑结构变化 4 DNA 碱基修饰变化 组蛋白的作用 组蛋白是碱性蛋白质,带正电荷,可与 DNA 链上带负电荷的磷酸基相结合。 组蛋白与 DNA 结合阻止 DNA 上基因的转录,去除组蛋白基因又能够转录。 转录活跃区域对核酸酶作敏感度增加 活跃进行转录的染色质区域受 DNaseⅠ消化常出现 100-200bp 的 DNA 片段, 且长短不均一, 说明其 DNA 受组蛋白掩盖的结构有变化, 出现了对 DNaseⅠ高敏感点 (hypersensitive site) 。 高敏感点常出现在转录基因的 5‘侧区、3‘末端或在基因上,多在调控蛋白结合位点的附 近,分析该区域核小体的结构发生变化,有利于调控蛋白的结合而促进转录。 染色质的活化 DNA 拓扑结构变化 天然双链 DNA 的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时,RNA 聚合酶转录方向前方 DNA 的构象是正性超螺旋,其后面的 DNA 为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体,有 利于 RNA 聚合酶向前移动转录;而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。

DNA 甲基化与基因表达 DNA 甲基化的主要形式 1 5-甲基胞嘧啶

2 N6-甲基腺嘌呤 3 7-甲基鸟嘌呤

4 在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出现在 CpG 和 CpXpG 中,原核生物中 CCA/TGG 和 GATC 也常被甲基化。 DNA 甲基化与基因表达 真核生物基因组 DNA 的甲基化(Methylation) 哺乳动物基因组中 5%的 C 为甲基化(m C),mC 主要存在于 CpG 二核苷酸中. CG 岛(CG islands): CpG 二核苷酸序列常成簇聚集并零散地分布于人基因组中, 形成 CpG 岛。 CpG 岛常与基因相连(可作为寻找基因的标记)。 DNA 甲基化和 CG 岛 由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失,所以,高等真核生物中 CG 序列远远低于其理论值。 哺乳类基因组中约存在 4 万个 CG islands,大多位于转录单元的 5'区。 DNA 甲基化与基因表达 基因甲基化状态: 1、高度甲基化: 基因为持续失活(如女性的一条 X 染色体; 2、诱导去甲基化:如组织或发育阶段特异性表达基因; 3、持续低水平甲基化:具有转录活性(如持家基因)。 简答题 简述真核细胞基因组结构特点及基因表达调控方式。 (10 分) (第四军医大分子生物学) 真核生物的基因表达调控可以在哪些水平上发生?何谓转录前调控,它有哪几种主要方式,

各发生在什么发育时期?试举例说明之。 (10 分) (中科院 2001 细胞学) 选择题 真核生物 DNA 中大约有百分之 2-7 的胞嘧啶存在甲基化修饰,绝大多数甲基化发生——二 核苷酸对上 A. CC B. CT C. CG (中科院上海生化所 98) D. CA

非洲爪蟾体细胞中 rDNA 拷贝数约有 500 个,而在卵母细胞中的拷贝数约增加了———倍, 可以用来转录合成 卵裂所需要的 ribosome。 a.1000 b.2000 c.4000 d.400 (中科院上海生化所 2001) 判断题 活跃转录的基因均位于常染色质中,处于异染色质中的基因通常不表达。 2. 转录水平的调控 2.1 基因转录的顺式调控元件 2.2 基因转录的反式作用因子 2.3 基因转录的基本条件 2.1 基因转录的顺式调控元件

顺式调控元件(cis-regulating element)是指对基因表达有调控活性的 DNA 序列,其活性只影 响与其自身同处于一个 DNA 分子上的基因. 2.1 基因转录的顺式调控元件 a. 正调控元件: 启动子(promoter) 增强子(enhancer)

b. 负调控元件—沉寂子(silencer) 负调控元件是能抑制基因表达的序列. c. 其它顺式调控元件 :应答元件 转座元件 启动子(promoter) 真核启动子一般包括转录起始点及其上游约 100-200bp 序列,包含有若干具有独立功能的 DNA 序列元件,每个元件约长 7-30bp。 启动子中的元件 核心启动子元件(core promoter element) 指 RNA 聚合酶起始转录所必需的最小的 DNA 序列, 包括转录起始点及其上游-25/-30bp 处的 TATA 盒。 上游启动子元件(upstream promoter elements) 包括通常位于-70bp 附近的 CAAT 盒和 GC 盒、 以及距转录起始点更远的上游元件。 增强子 增强子通常占 100-200bp 长度,也和启动子一样由若干组件构成,其基本核心组件常为 8-12bp,可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。 沉寂子 最早在酵母中 T 淋巴细胞的 T 抗原受体基因的转录和重排中发现证实。 沉寂子的作用可不受序列方向的影响, 也能远距离发挥作用, 并可对异源基因的表达起作用。 增强子与沉寂子概念的相对性 应答元件(response element) 定义:现代分子生物学上把能与某个(类)专一蛋白因子结合,从而控制基因特异表达的 DNA 上游序列称为应答元件。 功能:它们与细胞内高度专一的转录因子相互作用,协调相关基因的转录。 最常见的应答元件: 热激应答元件(heatshock response element,HSE)

糖皮质应答元件(glucocorticoid response element,GRE) 金属应答元件(metal response element,MRE) 铁应答元件(IRE) 2.2 基因转录的反式作用因子 转录水平的调控主要是通过与多种 DNA 元件结合的蛋白因子来实现. 反式作用因子(trans-acting factor)是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因 转录效率的一组蛋白质. 反式作用因子对基因表达的调控可正(激话)可负(阻遏). 补充:反式作用及反式作用元件 调控基因不仅能对同一条 DNA 链上的结构基因起表达调控作用,而且能对不在一条 DNA 链上的结构基因起作用,在遗传学实验上称为反式作用(trans-action) ,调控基因就属于反 式作用元件(trans-acting element) ,其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子(trans-acting factor) 。 2.2.1 反式作用因子的结构区域 DNA 结合域(DNA binding domain) ,多由 60-100 个氨基酸残基组成的几个亚区组成。 转录激活域 (activating domain) 常由 30-100 氨基酸残基组成, , 这结构域有富含酸性氨基酸、 富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类,一酸性结构域最多见; 连接区,即连接上两个结构域的部分。 a.反式作用因子的 DNA 结构域 结构域(domain):是指蛋白质中可以具有独立的超二级结构的部分。 通常由一个基因外显子编 码,并可具有特定的功能。在较大的蛋白质中,多个结构域间可通过较短的多肽柔性区互相 联接. 基序(motif):一般指构成任何一种特征序列的基本结构.作为结构域中的亚单元,其功能是 体现结构域的多种生物学作用. 1. DNA 结合结构域基序 a. Helix-turn-helix(螺旋-转角-螺旋) 。是最早发现于原核生物中的一个关键因子,该结构域 长约 20 个 aa,主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。其中的一个被称为识别螺旋区,

因为它常常带有数个直接与 DNA 序列相识别的氨基酸。 b. Zinc finger(锌指) 。长约 30 个 aa,其中 4 个氨基酸(Cys 或 2 个 Cys,两个 His)与一个 Zinc 原子相结合。与 Zinc 结合后锌指结构较稳定。 c. Homeodomain(同源域) ,最早来自控制躯体发育的基因,长约 60 个氨基酸,其中的 DNA 结合区与 helix-turn-helix motif 相似,人们把该 DNA 序列称为 homeobox。主要与 DNA 大 沟相结合。 d. Leucine zippers(亮氨酸拉链) 是亲脂性(amphipathic)的α螺旋,包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸,两条多肽链 以此形成二聚体。每隔 6 个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)组成 DNA 结合区。 几种常见基序 E 螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix,HLHt)基序 由 2 个α螺旋间隔一个非螺旋的环(loop)组成. 如原癌基因产物 C-myc 及其结合蛋白 Max. 2.3 特异性基因转录的基本条件: ①启动子(特别是核心启动子) ②转录模板(转录起始点(+1)---终止点) ③RNA PolⅡ ④普通转录因子(GTFs) 真核细胞的三种 RNA 聚合酶

转录因子与普通转录因子 以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcription factors,TF) 。 在真核基因转录中,一些转录因子是 RNA 聚合酶Ⅱ转录起始必需的, 并且可以维持基础水平 的转录,因此称为基础转录因子或普通转录因子(general transcription factor) 与 DNA 结合的转录因子大多以二聚体形式起作用

RNA 聚合酶Ⅱ的基本转录因子

3.转录后加工 在细胞核内对基因产物(mRNA 前体)进行各种修饰、剪接和编辑,使编码蛋白质的外显子部 分连接成为一个连续的开放读框(open reading frame,ORF)的过程称为转录后加工. 4.翻译水平调控 翻译起始因子(IF)的调节:可逆磷酸化的作用. 1.eIF-4F 的磷酸化激活蛋白质的合成. 2. eIF-2 的磷酸化引起翻译起始受阻,降低蛋白质的生物合成水平 mRNA 结构与翻译控制 (一) 5’-UTR 结构 1、mRNA5’端 m7G 帽有增强翻译水平的作用. 2、 “上游 AUG 密码子”(位于起始 AUG 上游的其他 AUG 密码子)的存在往往抑制下游开放 读框的翻译效率. 3、起始 AUG 旁侧序列对翻译效率的影响.Kozak 序列:GCCAUGG (二) 3’-UTR 结构 1.poly(A)尾增加翻译效率 2.富含 UA 序列抑制翻译。 mRNA 稳定性与翻译控制 mRNA 稳定性主要取决于 3’—UTR 结构 1)poly(A)尾增加 mRNA 稳定性, 2)3’-UTR 中 UA 序列导致 mRNA 不稳定. 5. 翻译后修饰 1 氨基酸侧链的共价修饰:乙酰化、磷酸化、糖基化(N-、O-)

2

蛋白质前体的切割和成熟。Proprotein→protein. 例:胰岛素的成熟。

蛋白质的磷酸化反应 指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的 一种普遍的调节方式,在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用 1 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。 2 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶"活性"。 3 对外界信号具有级联放大作用. 4 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。 本章重点掌握内容 真核基因表达调控特点 DNA 的甲基化与基因表达 真核基因调控顺式作用元件和反式作用因子的概念及种类 真核转录因子的结构区域 基本概念: 基因扩增 基因重排 启动子 增强子 Zinc finger Leucine-Zipper HLH 沉寂子 应答元件 motif Homeodomain HTH



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