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甲胎蛋白基因表达沉默对肝癌细胞系HepG2细胞周期的影响


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甲胎蛋白基因表达沉默对肝癌细胞系HepG2细胞周期的影响


董天皞,李晓丹,倪虹*,彭茜,张园

【摘要】 目的 研究 RNAi 介导的 AFP 基因沉默对肝癌 HepG2 细胞系细胞周期的影响。 方法 在 构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因的 shRNA 表达质粒的基础上,利用载体介导对肝癌细胞株 HepG2 进行转染,并成功沉默 AFP 基因表达,进而利用流式细胞术对转染细胞与非转染细胞之 间细胞周期的变化进行检测。结果 检测结果显示 AFP 基因沉默肝癌细胞株 HepG2 细胞较对照 组细胞的细胞周期各时期细胞百分率产生了显著的变化:其中 G1 期细胞百分率明显升高 (P<0.05) ,G2/M 期和 S 期明显降低(P<0.05) 。结论 研究表明 AFP 对肝癌细胞系 HepG2 的 细胞增殖有确定的促进作用,其作用机制可能是通过影响 G1 期相关调控蛋白表达实现的。 【主题词】质粒;甲胎蛋白;RNA 干扰;短发卡 RNA;HepG2

Effect of RNAi-mediated AFP Gene Silencing on cell cycles in HepG2 cell lines
DONG tian-hao*, LI xiao-dan, NI hong,et al.* College of Life Sciences,Nankai University, Tianjin 300071,China Corresponding author: NI hong, E-mail:tianhaonk@yahoo.com.cn

【Absrtact】Objective To study Effect of RNAi-mediated AFP Gene Silencing on cell cycles in HepG2 cell line. Methods A vector-derived short hairpin RNA (shRNA) expression system was developed to selectively inhibit expression of alpha-fetoprotein in HepG2 cell line. After identified by sequencing and gel electrophoresis, the shRNA expressing vector was used to transfect HepG2 cells by liposome. HepG2 cell clones, which the vector stably integrated into, were successfully selected by puromycin screening and then identified by RT-PCR and indirect immunofluorescence. Cell cycles of HepG2 cells and transfected HepG2 cell with no AFP gene expression were determined by FACS

作者简介:300071 天津,南开大学生命科学学院(董天皞,李晓丹) ;南开大学医学院(倪虹,彭茜,张园) 通信作者:倪虹 E-mail:tianhaonk@yahoo.com.cn

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analysis. Results After AFP gene was silenced in HepG2 cells, the percentage of cells in G2/M phase and S phase decreased respectively (P<0.05),but at the same time, the percentage of cells in G1/G0 phase show a significant increase (P<0.05). Conclusion The results presented here indicate that AFP enhances the proliferation of human hepatoma cells,such as HepG2 cells. And it is strongly inferred that AFP serves as an important enhancing factor in the expression of cyclins in G1 phase. 【Subject words】plasmid;alpha-fetoprotein;RNA interfering;short hairpin RNA;HepG2

甲胎蛋白(AFP)是一种确切生物学功能不明的胚胎期及肝癌相关蛋白,正常情况下新生 儿出生后,AFP表达即被关闭。但在肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤,AFP基因又可重 新表达。 以往人们认为AFP主要参与脂肪酸等物质运输和表现一定的免疫抑制作用。 但由于AFP 表达伴随着胚胎发育和肝细胞分裂旺盛过程,因而有学者提出它在肿瘤发生发展过程中不是一 种简单的伴随现象,而是促进一种肿瘤生长的内源性物质[1,2]。一些实验研究结果也印证了这一 观点,Dudich E等研究表明:低于0.1mg/ml的人AFP能刺激人肝癌细胞系HepG2、人乳腺癌细胞 系MCF7、人淋巴细胞系M74等多种细胞系的生长
[3,4]

。Wang XW等也做过类似的实验,并发现

0.025mg/ml的人AFP可显著促进人肝癌细胞BEL-7402和QGY-7703的增殖 [5],并且证明抗AFP单 克隆抗体可有效地阻断AFP对肝癌细胞BEL-7404的增殖作用[6]。但AFP调节细胞生长的确切机 制如何目前尚不清楚。 在本研究中我们针对甲胎蛋白编码区,构建了shRNA(Short Hairpin RNA)的表达载体 siSTRIKE-AFP,成功沉默了HepG2 细胞中AFP基因的表达,建立了稳定转染shRNA表达质粒的 HepG2 细胞克隆,对AFP基因在HepG2 细胞增殖中的作用机制进行了初步的探讨[7,8]。 材料与方法 1. 针对人甲胎蛋白(AFP)基因的 shRNA 表达质粒的构建

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为了构建 AFP 基因特异性的 shRNA 表达质粒,首先应进行靶序列的选择,从 GenBank 数 据库中检索出 AFP 基因的保守 mRNA 序列,利用 Promega 公司的设计引擎得到 shRNA 的靶序 列: 5′-GAGCGGCTGACATTATTATT-3′, 进而如图 1 所示设计并合成两条互补的寡核苷酸序 列用于构建 shRNA 表达质粒,序列如下:
5’-ACCGGAGCGGCTGACATTATTATTCAAGAGATAATAATGTCAGCCGCTCCTTTTTC-3’;

5’-TGCAGAAAAAGGAGCGGCTGACATTATTATCTCTTGAATAATAATGTCAGCCGCTC-3’。

图1 使用 PureYield Plasmid Midiprep System 试剂盒提取并纯化质粒。利用内切酶 PstI 酶切结合 琼脂糖电泳技术检验合成的寡核苷酸是否插入 siSTRIKE 质粒当中,并且应用 M13 通用引物测 序以确定是否有碱基异常的存在。 2. shRNA(short hairpin RNA)表达质粒转染 HepG2 细胞系并筛选稳定转染细胞系 人类肝癌细胞HepG2 由中国科学院生物物理研究所馈赠,用高糖DMEM培养液,37℃, 5%CO2条件下培养。转染前一天用处于指数生长期的HepG2 细胞铺 6 孔板(每孔约 1X105个细 胞),转染按脂质体产品(Promega,Inc)说明操作混匀并加入转染混合物(1.05μg质粒,3.15μ l脂质体/孔) ,然后溶于 400μl无血清无抗生素DMEM培养基,加样完毕后培养 5h,之后再加入 等体积含 20%小牛血清的无抗生素DMEM培养基。 并于转染 48 小时后, 利用含有Puromycin(2 μg/ml)的 10%小牛血清DMEM培养基进行筛选,以后每 3 天换一次液直至细胞克隆形成,然 后将细胞克隆转至培养瓶中分别大量培养。 3.稳定转染细胞克隆 AFP 基因沉默效果的 RT-PCR 鉴定和间接免疫荧光鉴定 按 TRIZOL Reagent 说明操作,提取总 RNA。采用可见光分光光度计(NanoDrop?ND-1000 Spetrophotometer)测量得到总 RNA 的浓度与质量。按每个体系 2μg 总 RNA 的量利用 AMV 逆转 录 酶 进 行 反 转 录 。 设 计 并 合 成 AFP 基 因 的 内 外 两 对 引 物 ( 外 引 物

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A:5’-GTTTCATCCACCACCAAC-3’;外引物 S:5’-AAAGCCCACTC CAGCATC-3’; 内引物 A:5’-TGTAAGCAACGAGAAACG-3’;外引物 S:5’-TTATGAGATAGCAAGAAGGC- 3’)对 AFP 基因进行套式 PCR 扩增,以 HepG2 细胞作为阳性对照并以人类成纤维细胞作为阴性对照。 荧光染色前一天用稳定转染的HepG2 细胞铺 6 孔板(每孔约 3 X 105个细胞),次日弃去培养 基,PBS清洗一次;加入 2ml 1%多聚甲醛(含 0.1% Triton X-100) ,4℃固定 30min;PBS清洗 2 次,每次 5min;加入封阻缓冲液封阻 30min;加入第一抗体,室温孵育 1h;PBS清洗 3 次,每 次 5min;加入第二抗体,室温孵育 2h;PBS清洗 3 次,每次 5min;加入 5-7μl抗淬灭剂 (Sigma,Inc),封片观察,并以HepG2 细胞作为阳性对照。 4. HepG2 细胞与成功沉默 AFP 基因的稳定转染细胞克隆细胞周期的流式细胞仪检测 将HepG2 细胞与以证明敲除AFP基因的HepG2 细胞(各 3 组)以 2 X 105个分别接种于 60 X 15mm培养皿中,使 48 小时后细胞汇合度达到 70%-80%;用胰蛋白酶将消化、固定和PI染色后 进行流式细胞仪分析。 5. 统计学方法 实验结果以均数±标准差表示,两组单个时期细胞百分率检测数据采用成组t 检验,并且两组细胞细胞分裂各个时期细胞百分率均数采用卡方检验,P<0.05有统计学意义, 统计分析采用SPSS 11.5软件完成。 结果 1.构建 shRNA 表达质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳结果 如图 2 所示,经琼脂糖凝胶电泳检测发现,碱裂法提取的质粒大小与试剂盒中的要求相同 (4.4Kb) ,且具有两个 PstI 酶切位点(产生了一个新的 PstI 酶切位点) ,自连质粒只有一个 PstI 酶切位点,因此证实有外源片段插入。
图2

2.测序

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经基因测序(如图 3) ,shRNA 靶序列编码区和反向互补序列编码区的测序结果与预先设计 完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在,表明已成功构建了针对 AFP 基因的 shRNA 表达质粒。 图3 3.稳定转染细胞克隆 AFP 基因沉默效果的 RT-PCR 鉴定 如图 4 所示,经过 RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳检测,之前构建的质粒 siSTRIKE-AFP 有效地 抑制了 HepG2 细胞的 AFP 基因的表达,但对其他基因(如持家基因 GAPDH)的表达无任何影 响,因此可以认为质粒 siSTRIKE-AFP 特异性地沉默了 AFP 基因。 图4 4. 稳定转染细胞克隆 AFP 基因沉默效果间接免疫荧光鉴定 如图 5 所示,经过间接免疫荧光检测,正常的 HepG2 细胞检测到特异性的荧光信号而稳定 转染细胞克隆几乎没有观察到明显的荧光,因此可以在蛋白水平上证明之前构建的质粒 siSTRIKE-AFP 成功地沉默了 AFP 基因。 图5 2.5 HepG2 细胞与成功沉默 AFP 基因的稳定转染细胞克隆细胞周期的流式细胞仪检测结果 利用流式细胞仪对HepG2 细胞与成功沉默AFP基因的稳定转染细胞克隆细胞周期进行流式 细胞仪检测。如表 1 所示,沉默AFP基因的HepG2 细胞较正常HepG2 细胞的细胞分裂各个时期 细胞百分率产生了显著的变化(х2=8.818,P<0.05) :G1 期细胞百分率明显升高(P<0.05) ,而 G2/M 期和S期明显降低 (P<0.05) 由于细胞G2/M 期和S期细胞百分率是细胞增殖的重要参数, 。 因此通过沉默AFP基因的HepG2 细胞G2/M 期和S期细胞百分率显著降低可以初步认为AFP对 HepG2 细胞自身增殖具有一定的促进作用。 表1

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讨论 甲胎蛋白(AFP)是一种胚胎期及肝癌相关蛋白,并与个体发育、组织再生、肿瘤发生密 切相关,因而自其被发现以来受到广泛的关注,尤其对其在肝癌细胞增殖中的作用更是如此。 由于AFP具有一定的免疫抑制作用已被证实,因此人们曾推测AFP是通过抑制机体免疫体 系,进而促进移植肿瘤细胞的生长,甚至导致体内肿瘤的发生。但AFP可促进肿瘤细胞增殖的 许多实验结果均为体外实验。实验中不存在免疫系统应答问题,因而可以肯定AFP对细胞生长 的调节作用并不仅是AFP具有免疫抑制作用所能解释的[9]。 AFP与多种生长因子的相互作用已经有很多报道,比如生理水平的AFP可以增强表皮生长 因子(EGF)的促有丝分裂活性,这表明在发育和肿瘤形成中,AFP可能参与生长因子介导的增殖 过程[9]。但Semenkova等发现生长因子剥夺反而可增加肝癌细胞HepG2细胞系中AFP促有丝分裂 活性[3],显示AFP可能存在独立于生长因子之外的促细胞生长的作用机制。 Mizejewski 等研究发现BEL-7404人类肝癌细胞系中有AFP表达[5],同时发现细胞膜上还存 在AFP的受体[10]。Wang XW等应用抗AFP单克隆抗体可有效地阻断AFP对癌细胞的增殖作用[6]。 Esteban C.等人利用免疫学和形态学的方法在人类大肠癌细胞株HT-29细胞系中发现AFP被特殊 受体内吞后,可重新被再循环到细胞表面的现象,并提出了AFP促进细胞生长的AFP/受体自循 环途径[11]。因此一些学者认为在人类肝癌细胞中也存在一个AFP/受体的自循环途径,介导AFP 内吞与再循环, 进而促进肿瘤细胞的生长[12]。 李孟森等研究表明AFP能促进表达AFP结合蛋白(受 体)的细胞(人肝癌Bel7402细胞和Hela细胞)从G1 期进入S 期;在一定剂量范围(10mg/ml~ 80mg/ ml),AFP可促进胞外Ca2 + 内流,胞内Ca2 + 池的Ca2 + 外溢,引起胞浆Ca2 + 升高并伴有细 胞内cAMP浓度升高和蛋白激酶A活性增高,因而认为AFP对细胞生长调节作用的机制是通过受 体介导→信息传递→基因表达调控实现的[9]。 本研究作者通过脂质体转染将构建的 shRNA(Short Hairpin RNA)的表达载体 siSTRIKE

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-AFP 导入 HepG2 细胞内并成功沉默了 AFP 基因表达,并使用 DMEM 选择培养基筛选得到稳 定转染的肝癌 HepG2 细胞克隆。流式细胞仪检测表明 AFP 基因表达沉默的 HepG2 细胞较对照 组 G2/M 期和 S 期细胞百分率显著降低,G1 期细胞比率升高,表明 AFP 基因具有促进细胞增 殖的作用。AFP 基因表达沉默可导致 HepG2 细胞阻滞于细胞周期 G1 期,且此结果与李孟森等 人在 AFP 结合蛋白阳性表达细胞的实验中结果相吻合,提示 AFP 可促进肿瘤细胞通过细胞周 期的 G1/ S 期检验点,作者推测 AFP 对肿瘤细胞的增殖作用很可能是通过其正性调节 G1 期细 胞周期调控蛋白表达实现的。另外,本实验中在 AFP 基因表达沉默后并没有观测到细胞出现明 显凋亡的现象,表明 AFP 促进细胞增殖不是通过抑制细胞凋亡的机制实现的。 参考文献 [1]Nunez EA. Biological role of alpha-fetoprotein in the endocrinological field: data and hypotheses.Tumour Biol. 1994;15(2):63-72. Review. [2] Dudich, I.V.; Semenkova, L.N.; Dudich, E.I. The role of biologically active ligands in the

structure and function of the human alpha-fetoprotein Immunology Letters Volume: 56, Issue: 1-3, May, 1997, pp. 243

[3]Semenkova LN,Dudich EIV, Dudich IV.Induction of apoptosis in human hepatoma cells by alpha-fetoprotein[J].Tumor Biol,1997,18(5):261-273. [4]Dudich E,Semenkova L,Gorbatova E,et al.Growthregulative activity of human alpha-fetoprotein Biol,1998,19(1):30. [5]Wang XW,Xu B.Stimulation of tumor-cell growth by alpha-fetoprotein[J].Int J Cancer,1998,75(4):596.
[6]Wang XW,Xie H.Alphafetoprotein enhances the proliferation of human hepatoma cells in

for

different

types

of

tumor

and

normal

cells[J].Tumour

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vitro[J].Life Sci,1999,64(1):17-23. [7]Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A System for Stable Expression of Short Interfering

RNAs in Mammalian Cells[J].Science,2002,296(5567):550-553. [8]Miyagishi M,Taira K.U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’ over hangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells[J].Nat

Biotech,2002,20(5):797-500.
[9] 李 孟 森 , 李 平 风 , 李 刚 . 甲 胎 蛋 白 对 细 胞 增 殖 的 调 节 作 用 [J]. 国 外 医 学 肿 瘤 学 分 册,2000,27(5):286-288.

[10]Mizejewski, G.J.,Young, S.R. and Allen, R.P., Alpha-fetoprotein: effect of heterologous
anti-serum on hepatoma cells in vitro. J. nat. Cancer Inst., 54,1361–1367 (1975).

[11]Esteban C, Geuskens M, Uriel J., Activation of an alpha-fetoprotein (AFP)/receptor
autocrine loop in HT-29 human colon carcinoma cells.Int J Cancer. Sep 30;49(3):425-30, 1991

[12] 黄 健 , 蔡 美 英 . 针 对 甲 胎 蛋 白 的 肝 癌 免 疫 治 疗 研 究 进 展 [J]. 临 床 肝 胆 病 杂 志,2001,17(4):203-205.

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图 1 shRNA 表达质粒的设计与构建

图 2 构建质粒琼脂糖凝胶电泳
1、2、3 为自建的 shRNA 表达载体被 Pst I 酶切的结果; M 为入 DNA Hind I 酶切 maker; 4 为没有酶切的 shRNA 表达载体。

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图 3 构建质粒测序结果
图 A 为构建质粒中 shRNA 靶序列编码区的测序结果, 图 B 为构建质粒中 shRNA 反向互补序列编码区的测序结果。

图 4 稳定转染细胞克隆 AFP 基因沉默效果的 RT-PCR 鉴定 泳道 A1、A2、A3 分别为人类成纤维细胞、HepG2 稳定转染细胞、 HepG2 细胞的 GAPDH 基因 RT-PCR 扩增结果; 泳道 B1、B2、B3 分别为人类成纤维细胞、HepG2 稳定转染细胞、 HepG2 细胞的 AFP 基因 RT-PCR 扩增结果; 泳道 M1、M2 为 marker。

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A

B

图 5 稳定转染细胞克隆 AFP 基因沉默效果间接免疫荧光鉴定 A 图为正常的 HepG2 细胞间接免疫荧光结果,可检测到特异性的荧光信号; B 图为稳定转染细胞克隆间接免疫荧光结果,几乎没有观察到明显的荧光。

表 1 敲除 AFP 基因对 HepG2 细胞细胞周期分布的影响(%,均数±标准差) HepG2 细胞 Cell cycle G0/G1 phase S phase G2/M phase
*

沉默 AFP 基因的 HepG2 细胞 (%) 75.67±3.11 6.47±2.21 17.87±0.90
*

(对照组)(%) 58.20±2.71 16.73±0.76 25.10±2.14

*

*

与对照组相比较,具有统计学意义(P<0.05)

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