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生物化学及细胞生物学部分整理



生物化学
一、 糖类
种类 单糖 二糖 多糖 植物 蔗糖,麦芽糖,纤维二糖 淀粉,纤维素,果胶,琼脂 乳糖 糖原,壳多糖(几丁质) 动物 共有 丙糖, 五碳糖, 葡萄糖 (六碳糖) 果糖(六碳糖,最甜的糖) 半乳糖(六碳糖)

蔗糖:1 葡萄糖+1 果糖 麦芽糖:2α -D-葡萄糖 纤维二糖:2β -D-葡萄糖 乳糖:1 葡萄糖+1 半乳糖

淀粉:n 个α -葡萄糖 纤维素:n 个β -葡萄糖

葡萄糖都是以 α-1,4 糖苷键(直链)和 α-1,6 糖苷键(支链)相连。 单糖均有还原性(属还原性糖) 多糖均没有还原性(属非还原性糖) 寡糖(主要是二糖和三糖) :①有还原性:麦芽糖,纤维二糖,异麦芽糖,乳糖 ②没有还原性:蔗糖,棉子糖 【例】下列糖中不具还原能力的是 ( ) A.葡萄糖 B.乳糖 C.蔗糖 D.麦芽糖 答案:C 葡萄糖在合成糖原的时候,每加上 1 个葡萄糖残基需消耗 2 个高能磷酸键

二、 蛋白质
蛋白质 N 含量平均为 16%(凯式定 N 法) 氨基酸残基的数目=蛋白质分子量/110 溶液的 pH 值低于某氨基酸的等电点时,则该氨基酸带净正电荷,在电场中向阴极移动。若 溶液的 pH 值高于某氨基酸的等电点时,则该氨基酸带净负电荷,在电场中向阳极移动。

酸性氨基酸:PI=1/2(PK1+PKR) 中性氨基酸:PI=1/2(PK1+PK2) 碱性氨基酸:PI=1/2(PK2+PKR) 蛋白质的最大吸收值在 280nm 处,核酸的紫外吸收最大吸收值在 260nm 附近

(一) 一部分较重要的归纳(具体可见精英教案 P1075) 、
1.按 R 基化学结构分类 ①脂肪族氨基酸(不全) 酸性氨基酸(带负电) :天冬氨酸(Asp) ,谷氨酸(Glu) 碱性氨基酸(正电) :赖氨酸(Lys) ,精氨酸(Arg) ,组氨酸(His) 含硫氨基酸:半胱氨酸(可形成二硫键) (Cys) ,甲硫氨酸(Met) 含羟基氨基酸:丝氨酸(Ser) ,苏氨酸(Thr) 含酰胺基氨基酸:天冬酰胺(Asn) ,谷氨酰胺(Gln) ②芳香族氨基酸:苯丙氨酸(Phe) ,酪氨酸(Tyr) ,色氨酸(Trp) ③杂环族氨基酸:组氨酸(His) ,脯氨酸(Pro) 2.、按 R 基极性分类 ①极性氨基酸(11 种) :酸性氨基酸(2 种) ,碱性氨基酸(3 种) ,含羟基氨基酸(2 种) , 含酰胺基氨基酸(2 种) ,酪氨酸(Tyr) ,半胱氨酸(Cys) ②非极性氨基酸(9 种) :Gly(甘), Ala(丙), Val(缬), Leu(亮), lle(异亮), Met(甲硫), Phe(苯丙), Pro(脯), Trp(色) 芳香族氨基酸在 280nm 波长附近有最大的紫外吸收率 His 咪唑基是 PKR 在 7.0 附近的唯一氨基酸,在生理 PH 下具有较大的缓冲能力 20 种蛋白质氨基酸在可见光区域皆没有光吸收 Gly 没有旋光性 Pro、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质,其他生成紫色物质 Pro 不能用氨基酸通式来表示 Pro、羟脯氨酸可中断 ?-螺旋 Pro 形成的肽键可以是反式的也可以是顺式的,一般是顺式的 酪氨酸(Tyr)在体内可以转变成肾上腺素 必需氨基酸是对人和动物而言的 组成谷胱甘肽的氨基酸有谷氨酸,半胱氨酸,甘氨酸 【例】在氨基酸的分类中,下面哪一个氨基酸属于芳香族氨基酸(2010 联赛) A.丙氨酸 B.丝氨酸 C.色氨酸 D.亮氨酸 测定一个五肽的氨基酸序列的最好方法是:Eadam 降解法 蛋白质α -螺旋结构的特点:天然蛋白质多为右手螺旋,每隔 3.6 个氨基酸螺旋上升一圈, 每个氨基酸残基上升高度为 0.15nm 双缩脲反应检测蛋白质,取决于完整的肽链 蛋白质的性质: (1)两性电解质,PH=PI 时,蛋白质溶解度最小

(2)胶体性质 (3)紫外吸收特性 氨基酸性质: (1)两性解离,PI=PH 肽链的断裂——酶解法和化学裂解法 酶解法

(4)变性作用

(5)变构作用

化学裂解法:

(二) 、氨基酸的化学反应
1. α -NH2 参加的反应 (1).α -NH2 与 2,4-二硝基氯苯(DNFB)或 FDNB 反应生成 DNP-氨基酸(黄色) (DNFB 又称为 Sanger 试剂,Sanger 法鉴定多肽链 N 末端氨基酸) (2).α -NH2 与苯异硫氰酸酯(PITC)反应 (这一反应是 Edrnan 法鉴定多肽或蛋白质 N 末端氨基酸的基础,在蛋白质氨基酸顺序分析 方面占重要地位) 2. α -COOH 参加的反应 氨基酸-COOH 成盐成酯后, -COOH 既被保护, 而-NH2 的活性得到加强, 故-NH2 的酰基化, 羟基化需在碱性溶液中进行 3. α -NH2 和α -COOH 共同参加的反应 (1)可与茚三酮反应生成紫色物质(Pro 和羟脯氨酸生成黄色物质) ,此反应长用于氨基酸 定性定量测定。多肽可与茚三酮反应生成蓝紫色物质,但肽越大,灵敏度越差,蛋白质也有 此颜色反应。 (2)成肽反应 4.侧链 R 基参加的反应(具体可见精英教案 p1082) 肽的化学反应 1. 茚三酮反应 2. 双缩脲反应:含有两个或两个以上肽键的多肽和蛋白质可与碱性铜试剂发生双缩脲反 应,生成紫红色化合物(此反应可测定蛋白质含量)

蛋白质的颜色反应可见 精英教案 P1103 【例】12.双缩脲反应主要用来定性或定量测定下列哪些项? (2 分) (2011 联赛) A.氨基酸 B.多肽 C.糖 D.脂 E.蛋白质 答案:BE

化学键 共价键 肽键 二硫键 氢键 非共价键 (次级键) 疏水键 盐键 范德华力

一级结构 + + — — — —

二级结构 — — + — — —

三级结构 — — + + + +

四级结构 — — + + + +

二级结构五种类型:α -螺旋,β -折叠(伸展的肽链结构,肽键平面折叠成齿状,可由两条 以上多肽链顺向或逆向平行排列而成) -转角,β -凸起,无规卷曲 ,β 超二级结构:三种基本组合:α α ,β α β ,β β β 结构域:四种:全α 结构域(反平行螺旋束) ,β 结构域,全β 结构域,富含金属或二硫 ,α 键的结构域 蛋白质结构中,二硫键的数目多,蛋白质结构的稳定性就越强。在生物体内起保护作用 的皮、角、毛发的蛋白质中,二硫键最多。 指甲、毛发以及有蹄类的蹄、角、羊毛等的成分都是呈α –螺旋的纤维蛋白,又称α –角蛋 白。 蚕丝、蛛丝中的β –角蛋白 肽键部分具有双键的性质,不可自由旋转,肽键上 4 个原子与相邻两个α -C 原子构成肽键 平面 蛋白质变性过程中不会破坏肽键 导致 DNA 变性的因素有温度,PH,压力等,适度和光线亮度不会引起 DNA 变性 蛋白质变性后会出现溶解度变小,构象发生改变(但构型不会发生改变)

(三) 、蛋白质分离提纯鉴定(具体可见精英教案 P1104)
一般原则: 前处理(将组织细胞捣碎) 粗分级(处理大量蛋白样品,浓缩蛋白液) (盐析法,等电点法,有机溶剂分级沉淀法) 细分级(凝胶过滤层析,离子交换层析,吸附层析,亲和层析) 电泳法鉴定 结晶(进一步提纯)

蛋白质混合物的分离方法: (一)根据分子大小不同 1.透析——利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质(将提纯的蛋白液装在半透膜的透析袋 里,放在 dH2O 中进行透析,透析外液可以更换,直至透析袋内无机盐降至最低值) 超过滤——利用压力或离心力,强使 H2O 和其他小分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上 2.密度梯度区带离心 蛋白质颗粒密度, 质量大的即沉降得快, 沉降到与其自身密度相等的介质梯度时即停止不前。 从而达到分离蛋白质的目的 3.凝胶过滤层析(又叫分子排阻层析,分子筛层析) (还可用于测定蛋白质分子量) 将凝胶颗粒放在适宜的溶剂中浸泡,使其充分膨胀,装入层析柱内。 加入待分离的蛋白质混合物 以同一溶剂洗脱:比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠孔内,就快速流出。比网孔小的分子 能进入凝胶珠网状结构,流速缓慢。从而分离分子大小不同的蛋白质 (二)根据溶解度差别 1.蛋白质等电点沉淀:可调节不同的 PH 值使蛋白质处于 PI 时,其所带静电荷为“0” ,蛋白 质分子容易结聚沉淀。 (此时沉淀出的蛋白质具有天然构象,可再溶于适当的缓冲容积) 2.蛋白质的盐溶和盐析: 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响, 常用中性盐有 (NH4) 2SO4, MgSO4,NaCl 低浓度时可增加蛋白质溶解度——盐溶 高浓度时很多蛋白质可从溶液中沉淀出来——盐析(具体原因可参见精英教案 P1105) (盐析后蛋白质处于天然构象,可再溶解) 3.有机溶剂分级沉淀法:一些有机溶剂,如甲醇,乙醇,丙酮等,可使蛋白质在水中溶解度 显著降低,控制有机溶剂浓度可分级沉淀蛋白质。 (沉淀出的蛋白质常伴随变性,不可再溶 解)低温操作且缩短处理时间可使变形速度减慢(具体原因可参见精英教案 P1106) 4.温度对蛋白质溶解度的影响:0-40℃,大部分球状蛋白溶解度随温度升高而增加 40-50℃以上,大部分蛋白质不稳定,开始变性 蛋白质的分离纯化一般在 0℃或更低温度下进行。 (三)根据电荷不同 1.电泳——在外电场作用下,带电颗粒向着与其电性相反的电极移动 所带静电荷数量越多,颗粒越小,越接近球形,在电场中泳动速度越快,反之越慢 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ,广泛用于蛋白质,酶,核酸等生物分子的分离,定性,定量 及少量的制备 采用 SDS-PAGE 测定蛋白质的分子量。 SDS-蛋白质复合物的泳动速度主要取决于分子量 等电聚焦是在聚丙烯酰胺凝胶中掺入两性电解质载体,在电场中可自动形成 PH 梯度。 蛋白质移向并聚焦(停留)在与其等电点相等的 PH 梯度处。等电聚焦具有很高的分辨率, 适于同功酶的鉴定,可以分开 PI 有 0.02PH 差异的蛋白质 双向电泳是等电聚焦和 SDS-PAGE 的组合。利用等电点进行第一项分离,然后利用分子 量进行第二项分离 2.离子交换层析: 蛋白质等生物大分子不能进入树脂交联结构, 故不能在一般的树脂上分离, 而纤维素和凝胶具有松散的网状结构,较大的表面积,大分子可以自由通过,交换容量比树 脂大,洗涤条件温和,回收率高。 蛋白质对离子交换剂的结合律取决于彼此相反电荷的吸引力。 而盐的存在可以降低离子交换 介质与蛋白质相反电荷的静电吸引力。改变洗脱液中的盐离子浓度和 PH,可使蛋白质按离 子交换剂亲和力的大小依次洗脱出来,结合力最小的蛋白质最先洗脱出来。

3.亲和层析(根据对配基的生物学特异性的分离方法) 将特异配基共价地连接到载体表面 将载体装到层析柱中 加入待分离蛋白质混合物 待提纯的蛋白质与配基结合而被吸附到载体表面,其他分子不被吸附而流出柱外 用自由配体分子溶液洗脱,使蛋白质从柱上洗脱出来

【例】蛋白质沉淀后,沉淀能溶解的是 ( ) A.AgNO3 沉淀 B.(NH4)2SO4 沉淀 C.苦味酸沉淀 D.三氯乙酸沉淀 解析:蛋白质沉淀可分为两类:1.非变性沉淀(可溶解)——破坏蛋白质胶体稳定性的因素, 而使蛋白质从溶液中沉淀析出。 (包括:等电点溶解,中性盐沉淀(盐析) ) 2.变性沉淀(不可溶解)——破坏蛋白质高级结构,蛋白质变性,使蛋白质不溶而沉淀 析出(包括:有机溶剂沉淀,重金属沉淀,有机酸沉淀) AgNO3 沉淀为重金属沉淀,苦味酸沉淀和三氯乙酸沉淀为有机酸沉淀,均是变性沉淀,不 溶解。 (NH4)2SO4 沉淀为中性盐沉淀(盐析)能溶解。 答案:B 【例】在生物大分子的分离纯化过程中,能将生物大分子与无机盐及有机小分子分 离的方法是以下哪些? (3分) (2010联赛) A.离子交换层析 B.凝胶过滤层析 C.滤纸过滤 D.透析 E.离心 答案:AD 【例】使用离心机离心l00毫升样品之前最重要的操作步骤是平衡,正确的操作是以 下哪一个?(1分) A.目测 B.用量筒量取同样体积的样品溶液分别倒入两个离心管中 C.用托盘天平平衡两个离心管,然后将样品溶液分别倒入离心管 D.将样品溶液分别倒入两个离心管中,然后用托盘天平进行平衡 答案:D 【例】蛋白质达到等电点时,蛋白质分子会出现以下哪些状态? A.表面净电荷为零 B.稳定性增加 C.溶解度最小 D.溶解度最大 答案:AC (2分)

(四) 、
Southern-blotting 用以检测 DNA 片段 (此杂交中需变性处理) Northern-blotting 用以检测 RNA (此杂交种无需进行变性处理) Western-blotting,Eastern-blotting 是检测蛋白质 Dot-blotting 可检测 DNA,RNA,蛋白质。 (具体原理课参见“精英教案,生物试题解析”P160) 【例】下列物质中具有旋光性的物质有( ) A.甘油醛 B.甘氨酸 C.葡萄糖 D.甘油

解析: 物质具有旋光性是由于该物质含有不对称碳原子而引起的。 甘氨酸没有不对称碳原子, 甘油是对称分子 答案:AC 蛋白质合成抑制剂:嘌呤毒素,抗菌素,毒素

(五) 、酶
抑制作用:1,可逆抑制剂: ①竞争性抑制(抑制剂与底物竞争与酶结合)Km↑ Vmax 不变 ②非竞争性抑制(抑制剂,底物与酶同时结合)Km 不变 Vmax↓(