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钾通道开放剂拮抗4—氨基吡啶诱发大鼠肥大细胞释放组胺


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药 学 学 报 AcaP a ma e t aSnc  9 {0 1 ) 3  ̄ 7 0 t  h    c u t   ii 1 , 3 (  :7 6 4   r c a 95 0

_ -  7 -   7

钾 通 道 开 放 剂 拮 抗 4氨 基 吡 啶 诱 发 大 鼠 肥 大 细 胞 释 放 组 胺   一 R ;  6 
陈 志 刚 徐 建 华   
r 浙江 医斟大 掌药 学 系药理学 教研 室 , 杭州 3 0 1  l 3) 0 摘要 4氨基 吡睫 ( — P 能诱 发大 鼠腹 腔肥大 细胞 ( Mc) 放组 胺 . 一  A ) P 释 且呈 浓度依 赖关 系。 通道  钾

开放 荆二 氯嗪 (  ) 米诺地 尔( n 及钙拮 抗剂 硝苯 啶 (  ) 能明 显抑制 4A D , Mi) N 均 - P诱发 大 鼠 P Mc释放  组胺 。 实验结 果提 示 . 鼠肥大 细胞膜 上可 能存 在钾 通道 , - P可 能通过阻 滞钾 通道 , 大 4A 使钙 通道 开放 ,   C 抖 内流增 加而促进 组胺 释放 , a 钾通 道开 放剂可 能是 一类 新的纽 胺释 放拮抗 剂 。   关键 调 钾 通道 开放剂 ·4氨基 毗啶 }肥 大细 胞 }组胺 释放  -

4氪 基吡啶 (一m n pr i ,- P 是一种 非选择性钾通 道阻 滞剂 . 促进 神经 末梢释 放  一 4a i yin 4A ) o de 能 乙酰胆 碱、去 甲肾上 腺索 与多 巴胺 等多种 神经递 质  , 也能 促进 胰 岛 B 胞分泌 胰岛素  。 细  
钾 通道 开 放 剂 二 氨 嗪 (i oieDa 能 抑 制 胰 岛 B细 胞 分 泌 胰 岛 索  。 年 来 又 发 现 4AP能  da xd , i) z 近 - 促 进 小 鼠 肥 大 细 胞 ( s cl, mat e MC) 放 组 胺 ’   l 释  。MC膜 上 有 钙 通 道  . 是 否 有 钾 通 道 尚未 得  但 到 确 认 。本 文 报 道 4A - P也 能 诱 发 大 鼠腹 腔 肥大 细 胞 (eina  scl P proel t el MC) 放 组 胺 , 通  t ma   , 释 钾

道 开放剂 Da 米 诺地 尔( i x i Mi) i、 m n il n 和钙 拮抗 剂硝 苯 啶 (idp e N ) 4A o d, n ei n , f 对 - P诱发大 鼠  f i P MC释 放 组 胺 有 拮抗 作 用 , 进 一 步 探 讨 4A 并 - P诱 发 肥 大 细 胞 释 放 组 胺 的 机 制 , MC存在 钾  为 通道提供实验依据 。  


动物







法 

Sr u— a l p g eD we 鼠, a y大 雌雄兼用 t 体重 25 9g 由本校 实验 动物 中心提供 。 0  ̄2  ,  
4AP Al - ( f 品 ) Di(im a产 ; a Sg a产 品 ) Mi 剂 ( ; n片 上海 黄 河 制 药 厂 ) i粉 剂  }Nl

药 钧和 试 剂

( 江温岭制药 厂) 浙 ;组胺 标 准 品 ( 国药 品 生物 制 品检 定 所 ) 中 {邻 苯 二 甲醛 ( P Fua药 厂 )  O T+lk ;

小牛 血清 ( 浙江杭 州四季青 乡) 高氯 酸 、 丁醇 、 ; 正 正庚烷 、 无水 甲醇 、 磷酸 二氢 钾、 酸氢 二钠 、 磷  
氯化 钾 、 化钙 、 化 钠 等 均 为分 析 纯 。 氯 氯   仪 暑  日立 F 4 0 荧 光 分 光 光 度 计 , 一0 0型 透射 电子 显微 镜 为 P ip M 1 hl s i E 4 0型 。  

试剂和药液的配制

4A - P溶液 , 组胺 标准液 , P O T无水 甲醇溶液 以及 P C孵化液配制均  M

与文献 相 同。 A M n和 Nl 1 羧 甲基纤维 紊钠 (Mc N ) i用   c — a 配成混悬液 。 i溶液 配制 ; .  Da 用0 1 m l L NO o ·   a H配成 2 m l L Da 备液 ; 6 5 mo ·   i储 在   d内使用 。 临用前 , P C孵化液稀 释至  用 M
5 0p l L , 节 p 0  mo · ~ 调 H值 至 7 2  .。

托 悬液钳备

取大 鼠 1只 , 头 处 死 , 开 腹部 皮肤 , 皮 肤 向 两 侧 翻 开 , 后 i 0ml 剪 剖 将 然 p1  

本 文于 19 9 5年 1, 2 日收 到 . I7     国 家 自然 科学 基 盘 资 助 项 日 。 号 3 2 0 8   编 97 78

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药 掌 学 报 Ac a P a m a c t a S n c l 9 3 ( O  I h    c u i   i i   5; 0 【 ):7 6 7     r c a 9 3  ̄    4 0

P MC孵 ( i . 轻 按 胯 腹 部 2 3ri.打 开 }腔 . 集 腹 腔 液 约 8m1 至  于  中 的 砖 化  E ̄ 轻 L ~   n a 『 复 收   .移 水浴
离心管 , 冷 】   i . 5r n   a 管 , | 备用 。   水浴   10   ×g离 心 5mi .弃 去 上清 液 . ^孵 化箍 定窖 . 匀 岳均 匀 分 戚 数  1     n 加 混

P MC孵 育

将 每管 0 5mI MC悬液  3  惜 巾预 热 5mi,分 别 加八 0 5 4AP 洋  .    P 7 C水 n .    (

晶管 ) P 或 MC孵 f 液 ( E 对照 管 )0 1 1 .  n1 5 .继续 孵 育 1  i.加 0c孵 化 液 至 I0m【 止 反 廊    rn 0a   .  终
冰浴 5mi n后 i 0 1 ×g离 心 5 ni。    l   h

用 含 Dj a的 P MC孵 化 液 处 理 P MC孵 化 液 预 孵 化 3  i. 0r n  a P MC悬液 中组 胺 含 量 的 测 定

将 P MC悬 漓 竹 3  7C水 浴 中 , 含 Da5 0i o -L 的  用 i 0 m l     i 参 照 文献 。  。取 P MC孵 育 后 的 匕清 液 用荧 光 法 测 组 胺 

F步 骧 同 P M(孵 育 

量 , 常 对 照 管 l . 样 品管 同 样 处 理 , 组 胺 释 放 量 为 P 正 管 与 就 MC的 组 胺 自 然 释 放  。碍取 未 经 

孵 育的 P MC悬 液 1管 , 10c水 浴 煮 沸 1  i 加孵 化 液 至 L 0ml上清 液 的 组 胺 台 量 为  髓   O   r n后 5a   , P MC含 组 胺 总 量 。每 个 样 品 管测 两 次 。结 果 以 P MC组 胺 释 放 量 占组 胺 总 量 的 百 分 率 表 示 。  

组 释 率 堂  壁  云 圆 胺 放 一 量塑 竖 盖   
P MC形 态 学观 察

×o l 0  

将P MC 悬 液 1 0 1 ×g离 心 5mi, 去 上 清 液 , 入 新 鲜 戊= 醛 (   n弃 加 : 4()  ,

用磷 酸缓 冲渡洗 3 ,l 唧 l 次   固定 1 , 磷 酸缓 :液 再洗 3次 ,   用 h 中 依次用 5   , 0 ,0 . 0 7  8   
9  }t 0 E0H脱 水  甩 10 EO 脱 水 3次 ,o %丙 酮 脱水 2次 , 一 步 骤均 为 1  i。 后  再 0   tH   1o   每 5r n 然 a 用 1:1的 丙 酮 与 包 埋 剂 浸 透 过 夜 , 埋 后 切 片 , 醋 酸 双 氧 铀 与 柠 檬 酸 铅 染 色 后 , P ip  包 用 在 hl s i E 40翌透 射 电子 显 微镜 下 观 察 。 M  1  

结 
4A - P对 大 鼠 P MC释 放 组 胺 的影 响  

果 

大鼠 8 1 ~ 2只 , 备 P 制 MC 悬 液 , 1只 大 鼠为 一 个 样 本 , 冰 浴 备 用 的 大 鼠 P 以 取 MC悬 液 .  

3l 7 顼热 5 l  c mn 样品管中加入 周裱度的 4 P   o - 溶液, ^   A 使Pt 悬液中 4 P c   - 或一浓度拂度- A  
孵育 后测其上清藏中组 胺 含量并计算不 厨的 4A - P浓 度时 的 P 熏 胺释 放翠 。 果表 明 ,~ MC 且 姑 4  

A 能诱发大卑孙 释放 P 组胺, 浓度 并呈 谯桢性。见   表
一  

  ‘

- 

  I

,  
.  

强  I {   一

钾 通道 开 放 剂 殛 钙 拮抗 剂 对 4AP诱 发 大鼠 P - MC释 放 组 胺  影响   大鼠 3 2只 , 机 分 成 4组 , 随 每组 8只 , 组 均 以 1 大 鼠 为 1个 样 本 制 备 P 各 只 MC悬 液 对 照  组 在 P   液 中加 入 4AP, 其 浓 度 为 1  o · ~ , 组 分 别 i Mi Ni, MC - 使 2mm l L 两 g n与 f另一 组 先 用 含    Di a的 P MC孵 化 液 孵 育 3   Om ,以 后操 作 步 骤 均 与 对 照 组 相 同 , 得 各 组 P 铡 MC 的 组 胺 释 放 

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f 学 学 报 ^caP nma.u i   l i   9 5 3 1 ):7 6      h    t a nr I 9 ;0   c r L c e a  c0 3 ~ 1  O

率 。 见表 2  。
Ta     Ef e t  f mi x d l n f d p n   d d a o i e O   ami p rd n b2 f cs o   no i i . le i i e an   i z x d   n 4- no y i l ef1   m o 2m |·L  、  
i d c d h s a ne r l a e f o   a   s l t d p r t ne l ma t c ls n u e   it mi   e e s   r m r t io a e   e io a   s   e l 

Ad e t m e u , i   on e r to   dd o dim t c c ntai n w孙 50   o s 0 um I·L 。 、 一 8, 。’P< 0.     0I

c onto . r 1 

给 大 鼠钾通 道 开 放 剂 Mi 0  n2 0mg· g i,4h后 处 死 . 备 P k— g   制 MC悬 液 , 育 后 测 定 上 清  孵 液 组 胺 含 量 , 得 4AP(2mm l·L ) 发 的 大 鼠 P 求 - 1  o   诱 MC 组 胺 释 放 率 为 1.   , 对 照 组  58 与

5.  比较有 显著差异( <0 们) 14 P . 。以含 Da5 0 0 ·  的 P C孵化液 处理 的大 鼠 P . i 0 m l L   M MC  孵 育 后 测 定 上 清 液 组 胺 含 量 , 得 4A 1  求 一 P( 2mmo l·L ) 发 的 大 鼠 P   诱 MC 组 胺 释 放 率 为 
1.  , 2 9 明显 低 于 对 照 组 ( < 0 0 ) P . 1  给 大 鼠钙 拮 抗 荆 Ni I5mg· g i,2h后 处 死 . 备 P f 2    k~ g   制 MC悬 液 . 育 后 测 定 上 清 藏 组   孵 胺含 量 . 得 4AP(2m l L ) 诱 发 的 P 求 - 1  mo ·   时 MC组 胺 释 放 率 为 7 8 , 对 照组 比较 有 显 著  .  与
差 异 ( < 0 0 )  P . 1。

钾通道开放剂对 4A - P诱发的大鼠 P MC脱曩 粒的影响  透 射 电子显微镜观 察 , 常 MC胞膜完 整 , 正 胞浆 内有大量含 电子致密物 质 的分 撼颗粒 . 颗  粒 密 度 高  4A 4mmo ·   ) - P(  l L 处理 后 . 多数 MC形 态 有 变 化 , 膜 基 本 完 整 , 内 有 少量 的 颗  胞 胞 粒排 出胞外 , 生脱 颗粒现象 。 用钾通 道开放荆 M n20m k 。 i   产 应 i 0  g· g。 g h后取 P C   。 ,4 M .可见 
4A - P引 起 的 MC脱 颗 粒 现 象 减 少  见图 I  

Fi    Elc r  mi r s o y o  l S  e l A - Nor lm a to lslB - Ex m oa t   - m l p rdne   g1 e to n c o c p   f t tc l  ̄ s- ma   s   ̄l    ,   o 4 a no y ii  4

mr o · L 。f r 1   n,s o n   x r so   f g a u e : C M . ( 0   nl - o   0 mi h wi g e tu i n o   r n l s . m 2 0 mg ·k ~ . g i h bt d t e g i ) n iie   h   d g a u a i l o   C e p  ̄ t   - mi o y Mi e × 7   0) e r n l t 1 fM   x o 0  s o 4a n p r n ( 1 0 .  

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药 学 学 报 AcaP a ma  ̄ t aSii    5 3 (   c  h  c u i     c l9 { 0 13:7 6   r c na 9 0 3 ~ 1  0

讨 

论 

4A - P能诱 发 小 鼠 舔 体 反应 与 促 进 皮 肤 及 腹 腔 MC释 放 组 胺  , 且 4AP所 诱 发 的 小 鼠  并  

P MC释放 组胺 作 用 可 被 钙 拮 抗 剂 Nl T   i和 MB 8及钾 通 道 开 放 剂 Mi 拮 抗 一。 本 文 用 大 鼠进  n所 。   行 实验 . 主要 考虑 到 不 同 种 属 的动 物 对 同 一组 胺 释 放 剂 的敏 感性 可 能 不 同 . 可 能 相 同 , 且  也 而 它 们释 放 组 胺 的 机 理 也 可 能 存 在差 异 …。本 实 验 结 果表 明 ,- 4AP也 能 促 进 大 鼠 P MC 释 放 组  胺 . 呈浓 度 依 赖性 , 作 用强 度 与 对 小 鼠 P 并 其 MC作 用 相近 。说 明 4AP的 怍用 与 常 用 研 究组 胺  - 释 放 的 工 具 药 化 合物 4/ 0cmpud4 / o 不 同 , 者 仪 大 鼠 MC敏 感 . 小 鼠 MC不 敏 感 。 8 8 (o o n  8 8 ) 后 丽   这 提 示 用 |AP为 工 具 药 研 究 MC释 放 组 胺 的机 理 可 能 是 有意 义 的 。   本 实 验 结 果 显示 钾通 道 开 放 刺 Mi. a和 钙 拮 抗 剂 Ni均 能 明 显 抑 制 4AP诱 茇 的 大 鼠  n Di f   P MC释 放 组 胺 。在 电子 显微 镜 下 观察 MC形 态变 化 , 4AP后 的 MC有 脱 颗 粒 现 象 。用 钾 通  给 - 道 开 放 剂 后 ,- P引 起 的 脱 颗 粒 现 象 减 少 。MC形 态学 改 变与 测 定组 胺 释 放率 所 得 结 果 相 符  4A
有 文 献 报 道 4A - P促 进 MC释 放 组 胺 同 时也 增 加 c   内流 【 一本 室 的 研 究 也 发现 4 A a “;   P的 

释 放 组 胺 作 用 具 有 c   依 赖 性 。 ,且 此 作 用可 被 钙拈 抗 剂 所 抑 制 。因 此 ,- P的 促 MC释 放  a   。 4A 组 胺 作 用可 能 与 MC上 钙 通 道 的开 放 有 联 系 。目前 MC上 存 在 钙 通 道 已 比较 明确 , 是 否 存 在  但 钾 通 道 有 待 进 一 步 确 证 。4A - P是 一种 非 选 择性 钾 通 道 阻滞 剂 , 能 阻 断 神 经 细 胞突 触前 膜 的  它

钾通道 , 导致钙 通道 开放 , 使更多 的 c 。进 入 突触 前膜 , a   从而使递质 释放 

4A - P促 进胰岛 B  

细 胞 分 泌 胰 岛 素部 分 也 是 由于 4AP直接 作 用 于 胰 岛 B细 胞 膜 , 少 胞 内 K - 减  外 流 而 促 进 c ”  a 内流 引 起[  。本 文 结 果 表 明 ,- 4AP诱 发大 鼠 P MC释 放 组 胺 作 用 既 能 被 钙 拮 抗 剂 拈 抗 , 能 被  也 钾 通 道 开 放 剂 所 抑 制 , 为 MC上 存 在 钾 通 道 提 供 了 进 一 步 实 验 证 据 。4A 此   P的 组 胺 释 放 机 制  很 可 能 是 它 阻 滞 了 MC上 的钾 通 道 , 而 使 钙 通 道 开 放 , a 内 流 增 加 , 致 MC释 放 组 胺 。 从 c“ 导   Ni可 能 阻 断 L型 c ”通 道 , 对抗 4A f a 其 - P引起 的 c 。 a 内流 , 抗 MC释 放 组 胺 , 属 于 直 接 对  拮 不 抗 。而 钾 通 道 开 放 剂 Mi n和 Da在 血 管 等 平 滑 肌 主 要 是 开 放 A P敏 感 K i T  通 道 ,Da抑 制 胰 岛  i B细 胞 释 放 胰 岛素 的 作 用 也 是 通 过 开 放 AT P敏感 K  通 道 E  。但 在 MC上 是 否 能 开 放 K  通 道  尚无 文 献 报 道 。本 文 结 果 提 示 . 药 可 能 通 过 开 放 MC的 K 两  通 道 . 加 MC膜 对 K 增  的 通 透 ,   胞 内 K  向 胞 外 , 流 直接 对抗 4A - P的 作 用 . 膜 电 位 更 负 . 超 极 化 . 使 膜 导致 电 压 依 赖性 钙 通 遭  
不 易 开 放 , 而 减 少 c   内 流 , 制 组 胺 释 放 。因 此 , 通 遭 开 放 剂 可 能 是 一 类 新 型 的 MC释  从 a’ 抑 钾 放 组 胺抑 制 剂 。  







献 
m船 .  

1 Ta i R ,Sig sM . Efe to   - m i o y ii e o t a mit rr la ei  yn lt ̄   pa te fc   f4 a n p rd n n r ns te  e e s n s aDo ome 、 s 
1 982· 250 2     91

2 Oams a G    m   t e s l  TM . W e trn    Bises P se i k BH C  2. - i m i p i n   n t e 4 d a no yrdie O   h  

. Dif r t   f e t  f  a i p i ne n   fe en i e f c s o  4 m no yrdi  a d al

w¨ r la e o   c t lh ie a d do a ie i   r ey m o i   a ee s   f a e y c ol   n   p m n   n fe l   n v ng r m 
J P a mo  ̄ . 1 8 . ●   hr x/ 9 8 1 5≈1   5

m e s rd b  n r ti a  i l ss 加 a u e   y i t asrat ld a y i .

3 Ahr n B , Le n r S· Lu d uit1 Ef e t    - mi o y i i e O  m s h   e r to   d p a m a   e  a de   n q s  . f c sof 4 a n p rd n   n u n s c ei n an   ls   g u o e l, I  i   i t c  a   a r n lc o ie — h m ial l c s   e e s n n a t nd d e a e t m z d c e c l s m p t e t ie   m ie  , v y  y a h om z d c、
,   , 】9 81. 74 :221  

. ,  

4 G a r n   G . PL n     rio M a t TD .H e u n J . Ef e t   f p t tv   c i a or   f K  c a e s i  II U e nq i   C f c s o   u a i e a tv t s o   h nn l  n T O S  

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70 4 

药 学 学 报 AcaP ama  f aS nc  9 ; 0  J: 3 t h    c l   iia I 5 3  1  7 6、7 0   r e 9 0    1
-  


pancr eatc 5 ce l . Br , Plrmac , } 9. i 1一 ls -. ue f 98 g8 :957  

5  

L b u  P, Ant n n   H , H e c uez A . K e rn o ieM r h l    c a ne o e r  a d n u i  r e s s h n l p ne s n  i s ln el a e
1 2. 99 5l : 7   95

f e -.  f  2 

6 林 宇红 , 镓建 华

1 氨基吡 啶诱发 小 鼠舔 体 反应与 肥大 细胞释 放组 胺.中国药理 学报 ,I9 ,5: "  一   4 1 29 9 1 4氨基 吡啶诱 发组 胺释 放及某 些药物 的拮 抗 作用.药学 学报 ,19 ,9:1 6   42 9    7

7 绦建华 , 吴吴 妹 , 莉 幸

8 Fo e   r man JC . M o g r JL_ Cal i m i no ho e  a d   n a    cu o p r s n  m o eme t f a c um i ns ol w i  t   v n  o  c l i o  f l o ng he p s o o i a   tm u u   nd t e s c e o y  r c s . hy i l g c ls i l s a   h   e r t r p o e s  Ⅳ" . 1 3 2 5 :2 9 ,    97 . 4 4 

9 宴 淑筠 , 云峰 符

血及组织 中组 织胺 的甍光 测定法


中 华压学棱 验杂 志 ,I8 ,   14:l i 9 O 
D if r n   r s on e   o   r d nt m a t c l t   fe e t e p s s f o e   s   el   o

0 B a a o E , M i to L , To f no G  e    o rt  et   fa   t
i ophos ys phatdyler ne. i s i  

[M s. 1 8,.     1 14 :613 9   

l El n   . Bo a   , Es n s  J K — h nn l b o k n   u s n uc   sam i e r l a e a d   e oN t na L pi a a . c a e   l c i g dr g  i d e hit n   ee s   n   up ak   n s l t d mas  ls , t e i io a e   tc l.   e ( A lr y Ap I f   l .   p   m ¨ tg   , 1 9 . 2: 1 2   09 9     6

C   a

2 绦 建华 , 王佩 , 陈志耐 等.钙 离 子 对 d 氧基 吡 啶诱发 肥大 细胞 释放 组胺 作用 的影响 .药学学 报 ,1 9 , 0 一   5 3  9
: 23   5

P AS I oT S UM   CHANNEL OP   ENE   RS ANT AGONI   一 ZE 4 AM  NOPYRI NE DI  
I NDUCED  I TAM I H S NE  RELEAS FROM   E  RAT  PEm TONEAL  AS CELLS  M T 

ZG  e   n   H    Ch n a d J Xu

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AB T AC   4 A n p r ie( - P SR T - mio y i n 4 A )wa h wn t po t hs mierl s fo  slt   d sso  o rmoe i a n ee e rm i ae     t a  o d
rtp rtn a  s el( MC)i    0  d p n e tma n r P tsim  h n e o n r .mio ii a  e i e lmatc l P o s n a d s一 e d n  n e . oa su c a n l p es e  e n xdl   ( n)2 0mg·k 。g.da o ie( a 0   mo Mi 0  g i iz xd Di )5 0 p l·L。   问 r  n   acu a tg n s nfdp n  u a d c li m  n a o it i iie   e

( l  5mg·k   i  r o n  o ihbt4 AP id c   itmierla  r m a  MC.E e to   Ni)J   2 g gweef u d t  i i -   u e hsa n  e s fo r t n   n d ee P lcr n
mir s o y r v a e  h t4 AP c u e   a t l e r n l t n o   c o c p  e e ld t a  -  a sd p ri   g a u a i   fPMC a d e tu i n o   r n lsa d M i  ad o   n   x r s   fg a u e  n   n o

2 0 mg’k 一 g r tre  hsDIn me o . "3 ers l   r vd   vd n e ta  oa s m  h n es 0  g  i ea d ti } o n n 1 e  e ut p o ie e ie c h tp tsi c a n l d   e 3s s u  
ae p ee ti rtma tc l me r n   n  n iac ta h   c a i o  i a n  ee s  y 4 AP r  rsn n a  s el mb a ea d idc t h tte me h ns     m  fhs mi erl e b   -   t a
ma   e r ltd t  sp t si m  h n e b o k n   fe t As   e u t ft i e f c ,t e c li m c a n l y b   a e  Oi   o su c e t a a n l lc i g e fc .     rs l o   s fe t h   a cu   h n e s a   h    
o n a d C   i l x t   h   a tc l  n r a e e p   n   a。 nfu  O t e m s  e l i c e ss, t use iii g h s m i  r la e P t s i m  h n e  s h   lctn   it a ne ee s . o su c a n l a

o n r  e me  o b     e   r u   f i h b t r  f hsa n   ee s   r m ma t e l. e p e ss e d t   e a n w g o p o   n i i s o   i mi e r la e fo   s c l   o t   s

Ke   rs y wod 

4 Amio y iie; P tsim c n e p n r Ma t el Hi a n  r l s ;   n p rdn oasu a h n l e e;  o s  c l; s mie ee e  t a

C li m  n g n s  a cu a t o i a t


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