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蛹虫草对人胃癌细胞BGC


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文章编号 : 1005 376X ( 2009) 02 0118 04

Ch in ese Journal of M icroeco logy , F eb 2009 , Vo l 21 N o 2 论 著

蛹虫草对人胃癌细胞 BGC 823 生长抑制与诱导凋亡作用研究
王林美 , 都兴范, 李学军, 李树英 ( 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 , 辽宁 大连 116024)

摘要 目的 研究蛹虫草水 提物 ( the aqueous ex tract of Co rdy cepM ilitar is , AEoCM ) 对人胃癌细胞 ( BGC 823) 生长抑制与凋亡诱导作用。 方法 采用不同浓度的 AEoCM 分别作用于胃癌 BGC 823 细胞 , 24、 48 和 72 h 后 , 应 用 倒置相差显微镜观察胃癌细胞的形态变化 , 四氮甲基 唑蓝 ( M TT ) 测定细 胞生长抑 制效应 , 流式 细胞仪 ( FCM ) 检 测 细胞周期 变化及凋亡率 , 免疫组化方法测 定 NK k BP65 的 表达。 结 果 A EoCM 能 显著抑 制 BGC 823 细胞增 殖 , 且 在一定的浓度范围内呈时间和浓度依 赖性。形态 学观察 发现 , 细胞变 暗、 皱缩 , 形状 不规 则 ; FCM 检 测结果 显示 , G 2 期的细胞于作用 72 h 后分布显著 增加 , 使细 胞阻滞于 G2 期。 0. 5 g /L AEoCM 在 24 、48 和 72 h 凋亡率 分别 为 4. 655 % 、11. 039% 和 19. 368% , 其 凋 亡程 度与 时 间呈 正相 关 , 免 疫 组化 方法 测 定 NK k BP65 的 表达 下 调。 结 论 A EoCM能明显抑制 BG C 823 细胞的生长 , 诱导其细胞凋亡 , 其诱导细胞凋 亡的机制可能与下调 NK k BP65 的表达有 关。 关键词 蛹虫草 ; 胃癌细胞 ; 凋亡 ; 细胞周期 ; NK k BP65
中图分类号 R 282. 740 . 5 文献标识码 A

S tudy on inhibition of p roliferation and induction of apop tosis in BGC 823 cell by cordycep m ilitaris
WANG L in m e,i DU X ing fan, L I Xue jun , L I Shu y ing
(D alian Institu te of B io techno logy, L iaoning A cademy of A gricultural Sciences , D alian 116024, China ) Ab stract O b jective T o study the effects o f the aqueous ex tract from Cordycep M ilitaris ( AEoCM ) on pro lifera tion and apopto sis of BGC 823 ce lls . M ethod BG C 823 w ere incubated w ith AEoCM at d ifferent concentrations for 24 h, 48 h and 72 h respective ly . The mo rpho logy of BGC 823 ce ll was observed unde r a lightm icroscope ; T he effects of AEoCM on ce ll pro life ration w ere m easured by M TT co lor m e tric assay ; F low Cytom etry ( FCM ) was used to detect ce ll cyc le d istr i bution and apopto tic rates; T he expression o fNK k BP65 w as exa m ined by the i m munohistoche m istry m e thod . Resu lt AEoCM inh ib ited the pro liferation o f BGC 823 ce lls in a ti m e and dose dependent manner . A fter exposure to cordycepin, the typ ica l m orpho log ica l features of apopto sis w ere observ ed, inc luding cell shr inkag e and darkness . The ce ll cycle o f BGC 823 was ap parently arrested in G2 phases by A EoCM in ti m e dependent m anne r . The apoptotic rates o f 0. 5 g /L A EoCM in 24 h, 48 h and 72 h ti m e interva ls we re 4. 655% , 11. 039% and 19. 368 % respective ly , and the express ion of NK k BP65 decreased sign ifican tly . Conc lu sion AE oCM inh ib its the pro liferation of BGC 823 ce lls and induces apoptosis , w hich may be assoc i ated w ith the down regu lation of the expression of NK k BP65. K ey w ords Cordycep m ilitaris ; BGC 823 ; A poptosis ; Ce ll cycle ; NK k BP65

胃癌在我国发病率较高, 临床上放疗和化疗是治 疗胃癌的主要手段, 这些手段除 了杀伤肿瘤细胞 以 外 , 对宿主的免疫系统也造成伤害 , 目前抗肿瘤药物 的药理研究已从化学治疗发展到免疫治疗。蛹虫草 又名北冬虫夏草 , 是我国传统的名贵药材, 具有补肺 益肾等多种功效 , 是扶正祛邪的良药之一, 现代药理 学研究证明 , 本品主要通过调节机体的免疫功能而发 挥其生物学效应
[1 , 2]

1 . 1 材料 1 . 1. 1 蛹虫草 由本单位虫草开发研究室提供。 1 . 1. 2 胃癌细胞株 BGC 823 为本单位细胞实验室 保存。 1 . 1. 3 主要试剂 RPM I 1640培养基购自美国 GIB

CO 公司 ; 胎牛 血清购 自兰州 民海 生物 工程有 限公 司 ; 二甲基亚砜 ( DM SO ) 购自天津科密欧试剂公司 ; 染色剂四甲基偶氮唑蓝 ( MTT ) 购自 Sigm a 公司; 顺铂 购自江 苏豪 森药 业股 份 有限 公 司; NK k BP65 购自 Santa Cruz生物科技有限公司; SP 免疫组化染色试剂 盒及 DAB 试剂盒购自北 京中杉金桥生物技术有限 公司。 1 . 1. 4 主要仪器 CO2 培养箱 (德国 H ERA ) , 倒置 光学显微 镜 ( O lym pus , 日 本 ), 全自 动酶标 仪 ( B I O RAD550), 超净工作台 (苏州苏净集团 ) , 低速离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) , 流式细胞仪 ( COULTER EP ICS XL ) , 96 、 24 孔细胞培养板购自 Costar公司。 1 . 2 方法 1 . 2. 1 蛹虫草水提物制备 取新鲜蛹虫草子实体 100 g 加水 1000 m , l 匀浆后 , 置 70 ! 水浴浸提 12 h, 离心, 上 清 液过 滤 除 菌, 即 得水 提 物 ( 含 鲜 草 100

。纪朋艳等

[ 3]

对蛹虫草的抗 肿

瘤活性进行研究。蛹虫草是虫草属的模式种, 与野生 虫草为同属异种真菌, 两者的化学成分、 营养成分和 药用功能非常相似, 主要活性物质含量高于野生冬虫 夏草
[ 4~ 7]

, 故可作为冬虫夏草的代用品。目前蛹虫草

治疗恶性肿瘤的研究已有报道 , 但蛹虫草治疗胃癌的 研究国内外尚未见有报道, 本研 究采用多种检测 方 法 , 研究蛹虫草对胃癌 BGC 823 细胞生长抑制 及诱 导凋亡变化 , 探讨该药治疗胃癌的依据。 1 材料与方法
收稿日期 2008 08 26 基金项目 辽宁省野蚕重点实验室资助 作者简介 王林美 ( 1966 ) , 女 , 助理研究 员 , 从事细 胞培养及 分子生 物学基础研究 , Em ai: lwl m 660925 @ 126 . com

中国微生态学杂志 g /L ) 。

2009 年 2 月第 21 卷第 2 期

119 心 5 m in , 弃上清 , 重新悬浮于 1 m 、 l 4 ! 预冷的盐水 G 中 , 缓慢加入 - 20 ! 预冷的 95 % 乙醇 3 m , l 使之终浓 度为 75 % , 冰浴 30 m in , 4 ! 保存。流式细胞仪的检 测分析由大连市中心医院中心实验室协同完成。 1 . 2. 6 免疫组织化学法测定 NK k BP65 的表达 本 实验采用酶标记的链霉素抗生物素蛋白 # 过氧化物 [ 11 ] 酶连接法 ( SP 法 ) 。结果判断 NK k BP65 抗体染色 阳性细胞为单纯胞核出现棕褐色颗粒或胞核和胞质 着色, 以胞核着色为主。高倍 ( 375倍 ) 视野下随机计 数 10 个视野 , 计 算阳性 的细 胞数 占细 胞总数 的百 分率。 1 . 2. 7 统计学方法 实验数据采用 SPSS 11 . 5 统计 软件单因素方差分析, 以 ( x ? s ) 表示; 计数资料采用 方差分析统计检验 , 以 P % 0 . 05 为差异有显著性。 2 结果 2 . 1 蛹虫草对 BGC 823 细胞生长的抑制作用 将 不同浓度的 AEoCM 加入 BGC 823细胞中作用 , 24 h, 其对 BGC 823 细胞作用的最小有效浓度为 1 . 0 g /L, 对细胞生长抑制率达 23 . 3% ; 48 h , 作用最小有效浓 度为 0 . 5 g /L, 对细胞生长抑制率达 34 . 2 % ; 72 h ,作 用最小有效 浓度为 0 . 1 g /L, 对 细胞生长 抑制率达 65 . 9 % 。阳性对照顺铂 1 m g /L 在 24 、 48 和 72 h 对 BGC 823细胞生长抑制率分别为 17 . 8 % 、56 . 4 %和 93 . 9 % 。 MTT 法显示 , AEoCM 对 BGC 823 细胞有显 著的抑制作用 , 呈时间剂量依赖性 (见表 1 和图 1)。

1 . 2 . 2 细胞 培养 将冻 存的胃癌细胞 株 BGC 823 [ 8] 从液氮 - 196 ! 中取出 , 细胞常规复苏 , 所用培养 液为 RP M I 1640 , 添加 10% 胎牛血清, pH 7 . 2~ 7 . 4 , 置于 37 ! 、 5% CO2 培养箱中培养 , 待细胞生长状态 良好时进行传代。 1 . 2 . 3 对 BGC 823 细胞的抑制作用 200 MTT 法
5 [ 9]

,将

对 数 生 长 期 的 BGC 823 细 胞 ( 1 ? 10 个 /m l ), l/孔加入 96 孔细胞培养板中 , 于 37 ! 、 5 % CO 2 培养箱中培养 4 h , 待细胞贴壁后分别加入一定浓度 AEoCM ( 0 . 1 、 0 . 2 、 0 . 5 、 1 . 0 、 2 . 0和 5 . 0 g /L ), 设置 RPM I 1640完全培养基作为阴性对照、 顺铂阳性对照 ( 终浓 度为 1 mg /L ), 每组 6个平行组, 37 ! 、 5 % CO2 培养箱 中分别培养 24 、 48 和 72 h 后, 加入 5 m g /m l MTT 20 l /孔, 继续孵育 4 h 后, 加入 150 l /孔 二甲 基亚砜 ( DM SO)溶解, 室温振荡 10 m in , 于全自动酶标仪检测 每孔 A 值 (测定波长 490 n m ) 。计算细胞生长抑制率。
细胞生长抑制率 = 药物组 A 值 - 本底值 A 值 ? 100% 对照组 A 值 - 本底值 A 值

1 . 2 . 4 观察细胞形态变化 倒置相差显微镜下观察未 加药的对照细胞和加药组细胞, 比较 AEoC M 诱导和未 经诱导的 BGC 823细胞 24 、 48和 72 h 形态学变化。 [ 10] 1 . 2 . 5 细胞凋亡检测 流式细胞光度术检测法 , 取对数生长期的 BGC 823细胞 ( 5 ? 10 个 /m l) , 加入
5

一定浓度 的 AEoCM ( 0 . 5 、 1 . 0和 5 . 0 g /L ) , 并设 置 RPM I 1640 完全 培 养基 阴性 对照、 顺 铂阳 性 对照 , 37 ! 、 5 % CO 2 培养箱中培养 48 h 后, 1000 r /m in 离
24 h ( x ? s) ( A 值 ) 0 . 993 ? 0. 138 0 . 912 ? 0. 065 0 . 887 ? 0. 070 0 . 807 ? 0. 098 0 . 699 ? 0. 105 0 . 532 ? 0. 045 1 . 052 ? 0. 051 0 . 865 ? 0. 068

表 1 AEoCM 对 BGC 823 细胞生长的抑制作用
组别 0 . 1 g/ L 0 . 2 g/ L 0 . 5 g/ L 1 . 0 g/ L 2 . 0 g/ L 5 . 0 g/ L RPM I 1640 阴性对照 顺铂阳性对照 1 m g /L 抑瘤率 % 5. 6 13. 3 15. 7 23. 3 33. 6 49. 5 17. 8 48 h ( x ? s) ( A 值 ) 0. 820 ? 0 . 038 0. 813 ? 0 . 050 0. 733 ? 0 . 047 0. 734 ? 0 . 060 0. 551 ? 0 . 116 0. 409 ? 0 . 047 1. 114 ? 0 . 036 0. 486 ? 0 . 030 抑瘤率 % 26 .4 27 .0 34 .2 34 .2 50 .5 63 .3 56 .4 72 h ( x ? s) ( A 值 ) 0 . 734 ? 0. 166 0 . 721 ? 0. 071 0 . 592 ? 0. 092 0 . 480 ? 0. 119 0 . 283 ? 0. 013 0 . 203 ? 0. 036 2 . 151 ? 0. 194 0 . 130 ? 0. 040 抑瘤率 % 65 . 9 66 . 5 72 . 5 77 . 7 86 . 8 90 . 5 93 . 9

注 : AE oC M 在所试浓度下对 BGC 823细胞具有极强的抑制作用 , * P < 0. 01

形贴壁生长 , 大小均一, 细胞分裂生长较快 , 透明 ( 图 2~ 图 4) 。用药组细胞增殖缓慢 , 0 . 5 g /L 细胞生长 明显受到抑制 , 并且随用药时间延长, 细胞数明显减 少, 细胞膜加深 , 变暗 , 细胞变不规则 (图 5~ 图 7)。 2 . 3 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 AEoCM 作用 BGC 823 细胞 24 、 48 和 72 h 后 , 对照组细胞大 多数处于 G1 期及 S 期, G2 M 期最少 , 其 凋亡 率是 1 . 316 %; 0 . 5 g /L AEoCM 实验组出现了亚 G0 /G 1 期 , 通常认为此期细胞为凋亡细胞, 其凋亡率随着作用时 间的延长在 24 、 48 和 72 h 分别为 4 . 655 %、 11 . 039 % 和 19 . 368% , 可见其凋亡程度与时间呈正相关。顺铂 阳性 对照 1 m g /L 作 用 BGC 823 细 胞 48 h 后 , 其 凋

图 1 AEoCM 对 BG C 823 细胞的抑制作用

2 . 2 对 BGC 823 细胞形态的影响 倒置显微镜下观 察 BGC 823 细胞未给药组的培养细胞生长良好, 呈梭

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亡率是 31 . 076 % 。 AEoCM 作用 72 h 以后 , G2 期的细 胞分布显著增加 , 证明 AEoCM 对细胞周期的阻断效 应 ( 见表 2 , 图 8~ 图 12)。
表 2 A EoCM 对 BGC 823 各细胞周期 DNA 比例及凋亡率的影响 组别 0h 24 h 48 h 72 h G 1 (% ) 47. 493 47. 053 48. 418 57. 646 S(% ) 46. 218 39. 587 38. 655 22. 814 G2 ( % ) 凋亡率 (% ) 6. 288 1. 316 13. 355 4. 655 12. 937 11. 039 19. 540 19. 368

行诱导凋亡的研究取得了可喜的成果 , 凋亡的异常在 胃癌的发生、 发 展和转 归中 的作用 已经 得到 肯定。 IS H II等
[ 14]

指出, 低度凋亡和高度增殖共同促进了胃

癌的发生。因此具有诱导胃癌细胞凋亡效应的药物 , 在胃癌的临床治疗中将具有良好的应用前景。本实 验 MTT 的研究结果表明, AEoCM 对 BGC 823 细胞有 显著的抑制作用 , 呈时间剂量依赖性, 胃癌 BGC 823 细胞株具有抑制增 殖作用, 且表现出 明显的量效关 系 ; 我们从流式细胞术分析细胞凋亡改变, 并观察到 蛹虫草可降低胃癌细胞 NK k BP65 蛋白表达水平 , 证 实蛹虫草有诱导胃癌细胞系凋亡的作用。 实验中, 我们选用了 BGC 823 细 胞株作为胃癌 细胞的代表, 从而使获得的实验结果对于我国的胃癌 治疗工作、 以及将蛹虫草应用于临床胃癌治疗提供了 较有针对性的参考价值。综上所述, 蛹虫草能够明显 抑制胃癌 BGC 823 细胞的增殖、 诱导细胞发生凋亡 , 此结果为蛹虫草的临床应用提供了依据。 另外, 本实验进一步证明 , 蛹虫草对癌细胞恶性 增殖有明显的抑制作用及诱导分化效应, 其作用机制 可能是通过对细胞中肿瘤相关基因表达的调节来实 现的。

2 . 4 对 BGC 823 细胞 NK k BP 65 表达的影响 AE oCM 作用 24 h , NF k BP 65的表达下调 , 阳性对照组顺 铂为 28 . 5% , 蛹虫草组为 11. 6 % , 与对照组比较差异 有非常显著性 ( P = 0 . 001) ( 图 13)。 3 讨论 近年来的研究结果表明, 肿瘤的发生发展不仅与 肿瘤分化异常及细胞增殖过度有关, 而且亦与细胞凋 亡减少有关 。随着对细胞凋亡机制研究的深入 , 发现多数抗肿瘤药物均具有可诱导肿瘤细胞凋亡的 作用
[ 13] [ 12 ]

。中药治疗肿瘤是我国在肿瘤治疗上的一大

特色, 由于中药的毒副作用小 , 对人体损害少甚至无 害 , 使得中药抗肿瘤研究备受关注。国内外学者应用 中药单药、 复方或从中提取的有效成分对肿瘤细胞进

中国微生态学杂志

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参考文献
[ 1] 张 力 . 冬 虫 夏 草 的 药 理 学 研 究 进 展 [ J ] . 药 学 通 报 , 1988, 23 ( 9 ): 521 . [ 2] 张宏 . 冬虫夏 草的 免疫药 理作 用 [ J] . 中 西医 结合 杂 志, 1994, 10 ( 9 ): 570 . [ 3] 纪朋艳 , 罗速 , 崔 新颖 , 等 . 中药 蛹虫草 的抗肿 瘤活性 及机制 研究 [ J] . 北华大学学报 , 2005, 6 ( 4) : 324 329 . [ 4] 马冰如 , 何玲 , 张 甲生 , 等 . 蚕蛹 虫草与 冬虫夏 草化学 成分的 比较 [ J] . 中国食用菌, 1994 , 13 ( 1) : 34 37 . [ 5] 张显科 , 王玉柱 , 刘文霞 . 蛹虫草与 冬虫夏草化学成 分比较 [ J] . 辽 宁大学学报 ( 自然科学版 ) , 1996, 23( 4) : 79 82. [ 6] 彭国平 , 李红阳 , 袁永泰 . 冬虫夏草 与人工蛹虫草的 成分比较 [ J] . 南京中医药大学学报 , 1996 , 12( 5 ): 26 28 . [ 7] 李祥麟 , 石玉洁 , 黄檀溪 . 略述北冬虫 夏草生物流 行性物质 的应用 ( 临床 ) 试验研究 [ J] . 传染病药学 , 2003 , 13( 4 ): l3 l6 . [ 8] 司徒镇强 , 吴军正 . 细胞培养 [ M ] . 西安 : 世界图书出版公司 , 2004 : 78 88 .

[ 9 ]孙等军 , 方琴 , 王秀石 . 榄香烯对人肝癌细胞 7402 、 宫颈癌细胞 H e la的凋亡诱导作用及下调 B cl 2 蛋白表达 [ J]. 复旦学报 , 2001, 28 ( 5) : 403 405 . [ 10 ]赵卫 红 , 寿 好 长 . 细 胞 凋 亡 [ J ]. 郑 州 : 河 南 医 科 大学 出 版 社 , 1997 : 58 . [ 11 ] 丁向萍 , 马 力 , 魏书 堂, 等 . 虫草 素诱导人 肝癌 H epG 2 细胞 凋亡 及对端粒酶活性影响的研究 [ J] . 中华肿瘤防治杂志 , 2008 , 15 ( 2 ) 109 112. [ 12 ]涂水平 , 江石湖 , 吴裕炘 . 胃、 肠肿瘤凋亡 治疗研究 的现状及 前景 [ J]. 中华消化杂志 , 2000, 20( 2) : 119 121. [ 13 ]江石湖 , 涂水平 , 谭继宏 , 等 . 羟基喜树碱 诱导胃癌 细胞凋亡 的实 验研究 [ J]. 中华消化杂志 , 1999, 19( 1 ) : 19 . [ 14 ] IS H II H H, GO BE G C, PAN W, et a.l A pop tos is and cell p roliferat ion in th e developm ent of gastric carcinom as : associations w ith c myc and P53 p rotein expression[ J] . J G astroenterolH epato, l 2002 , 17( 9 ) : 966 972 .



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