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丛枝菌根侵染率研究


丛枝菌根研究方法
一、检测孢子含量的方法 A 湿筛倾注法
1. 称取一定重量的土壤样品(最好是取自 15cm 表层植物根系附近的土壤) ,放在容器内用 水浸泡 20-30min,使土壤松散。如果土壤粘性很大,也可加入各种土壤分散剂。 2. 选用一套洁净的具有孔径为 0.5-0.034mm 的土壤筛,依次重叠起来。最底层用一物体垫 着(如培养皿、木块等物) ,使筛面稍微倾斜。 3. 用玻璃棒搅动浸泡的水溶液,停置几秒钟后,使大的石砾和杂物沉淀下去,即将悬浮的 土壤溶液慢慢地倒在最上一层孔径最大的土壤筛上。 倾倒时, 最好集中倒在筛面的一个点上, 不要使整个筛面都沾有土壤溶液。 4. 用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物, 以免在上层粗筛面的剩留物中夹藏有 VA 菌 根真菌孢子。 5. 用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面,再将滤液通过细筛 并用水冲洗。在冲下来的筛出物中,除有许多细的沙砾和杂质外,就含有 VA 菌根真菌的不 同直径的孢子。 6. 将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察。

B 蔗糖离心法
1. 称取 10 g 菌剂,置入大烧杯中加 500 ml 水,搅拌,静置 10 s。 2. 先后过 80 目分样筛、400 目分样筛,将 400 目筛子上的残余物用药匙转入 50ml 离心管 中,后用清水冲洗筛子,将残余物全部转入离心管中,配平,3000 转/min 离心 10 min。 (注 分样筛最好直径为 12 cm 左右,便于下面放置烧杯过筛) 3. 去掉上清液,在离心管中加入预先配制好的质量分数为 50%的蔗糖溶液,玻璃棒搅匀, 配平,3000 转/min 离心 10 min(注意离心前离心管壁上不能有残余物) 。 4. 将 400 目筛子呈一斜面放置,离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧,用水将筛子上的残留物 轻轻洗入划线培养皿中。 (注意水不能加太多以防影响检测,培养皿划线便于统计) 。 5. 解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目,计算出菌剂中的孢子含量。 注:溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。 A.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244 B .刘润进,李晓林.2000.丛枝菌根及其应用.北京:科学出版社:190-194

二、检测菌根侵染率的方法(曲利苯蓝染色改良法)
Phillips J M,Hayman D S,1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158~161

挑根—碱液软化—酸化—染色—脱色—制片、镜检
1.将洗净的粗细合适的根系剪成 1 cm 左右的根段至于三角瓶中。 2.加入 10% KOH 在 90℃的水浴锅中染色 45~60 min(去除细胞质,便于染色。一般幼根 需要时间较短约 0.5 h,老根需要时间长约 1 h,以根系相对透明为标准)。

3.弃去碱液,用清水洗 3~5 次(晾至室温后再冲洗) ,加入 2%盐酸室温下酸化 5 min。 4.加入 0.05%曲利苯蓝于 90℃水浴锅中染色 30min。 5.去除曲利苯蓝后, 弃去溶液后用自来水冲洗, 加入乳酸甘油溶液(1:1:1 )室温下脱色 24h, (晾至室温后再冲洗,也可直接脱色) 。 6.用镊子夹取 15 条排列在载玻片上,每个样 30 条 2 个片,显微镜镜检(10×10) 。 说明: 常规制片用水即可, 或封固剂 (聚乙烯醇 1.66g, 甘油 1 ml, 乳酸 20ml , 蒸馏水 10ml) 制片片子可以保存较长时间, 但容易产生气泡, 经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。

三、统计方法
Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al 丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot 等,1986)
?

Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221.
?

1.将 15 个根段固定在 1 张载玻片上,30 个染色后的植物须根根段制 2 个片子。 2.在显微镜下观察这些根段,按照图 1 的分类方法确定分级,这种分级包括对每 个根段菌根侵染率水平和丛枝丰度的快速评估。 3.将观测值代入计算机软件“Mycocale”中即可按照以下相关公式计算出相关的 菌根侵染度参数:%F,%M,%m, %a 和%A (Trouvelot et al 1986)
o o o

o

o

o o

Frequency of mycorrhiza in the root system 根系中的菌根侵染率(%F)=有菌根根段数/总根段数*100 F% = ( nb of fragments myco/total nb)*100 Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root system 根系中的菌根侵染强度(%M)=( 95*侵染率 90%以上根段数+70*侵 染率 50%至 90%的根段数+30*侵染率 10%至 50%的根段数+ 5* 侵染率 10%以下 1%以上根段数+ 侵染率 1%以下根段数)/总根段 数*100 M% = (95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/(nb total) where n5 = number of fragments rated 5; n4 = number of fragments 4 etc. Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root fragments 相对菌根强度即根段中的菌根侵染强度(%m)=M*总根段数)/有菌 根根段数 m% = M*(nb total)/(nb myco) Arbuscule abundance in mycorrhizal parts of root fragments a% = (100mA3+50mA2+10mA1)/100 (相对丛枝率)菌根根段丛枝率(%a)=( 100*mA3+50mA2 +

o

o

10mA1)/100,其中 mA3,mA2,mA1 分别是 A3,A2,A1 所对应的 菌根侵染强度 where mA3, mA2, mA1 are the % of m, rated A3, A2, A1, respectively, with mA3=((95n5A3+70n4A3+30n3A3+5n2A3+n1A3)/nb myco)*100/m and the same for A2 and A1. Arbuscule abundance in the root system (绝对丛枝率)根系丛枝率(A%) = a*(M/100)

Figure 1
注:现在找不到“Mycocale”这个软件了,我一般都是显微镜检测后自己计算 结果。统计菌根侵染率的方法有很多,有网格交叉法、频率标准法等,可以搜一 下相关文献。另附《丛枝菌根及其应用》 (刘润进,李晓林主编,2000,科学出版社)的
190-199 页。

四、球囊霉素相关土壤蛋白
试剂配制:

1.

柠檬酸钠浸提剂的配制:分别称取 14.705g、5.882g 柠檬酸钠溶于 500ml 去离子水 中,定容到 1L,即 50mmol L-1pH 调至 8.0、20mmol L-1pH 调至 7.0 柠檬酸钠

2.

牛血清蛋白标准溶液:称取 100mg0.001 牛血清蛋白溶于蒸馏水中,定容到 100ml 即为 1g L-1 的牛血清蛋白标准溶液,稀释 10 倍(现配现用)

3.

考马斯亮蓝染色剂的配制:称取考马斯亮蓝 G250 100mg 加 95%乙醇 50ml,加 85% (m/V)磷酸 100ml,去离子水稀释至 1000ml,保存于棕色瓶中

试剂 Reagent 牛血清蛋白 ml 蒸馏水 ml 蛋白质浓度 μg/ml 1 0 1.0 0.00 2 0.2 0.8 3.33

试管编号 Tube number 3 0.3 0.7 5.00 4 0.4 0.6 6.67 5 0.5 0.5 8.33 6 0.6 0.4 10.0 7 0.7 0.3 11.67

球囊霉素相关土壤蛋白的提取:
4. 易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EEG) :分别称取土样 1.00 g 于带刻度离心管中, 对应加入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(20 mmol.L-1、pH 值 7.0),加盖,摇匀,在 103 kPa、 121℃下提取 30 min,10 000×g 下离心 6 min,收集上清液,每个处理重复 4 次,提 取 1 次,用蓝色记号笔。 5. 总球囊霉素相关土壤蛋白(TG) :分别秤取土样 1.00g 于带刻度离心管中,对应加 入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(50 mmol.L-1、 pH 值 8.0),加盖,摇匀,在 103 kPa、 121℃下 提取 60 min,, 再重复提取 5 次,每次重复提取时,保证提取液体积固定且摇匀土样, 使土样与浸提剂充分接触;每提取一次之后迅速在 10 000×g 下离心 6 min,将上浮 物从土壤中分离出去,收集上清液,每个处理重复 4 次。 上清液储藏在 4℃下直至第 2 天分析。 球囊霉素相关蛋白的测定:分别吸取 0.5 mL 的上清液,加入 5 mL 考马斯亮蓝 G-250 染色剂(使用之前过滤),加盖,震荡,显色 10 min,于 595 nm 波长下比色。用牛血清白蛋白 (Bovine albumin,BSA)作标准液,考马斯亮蓝法显色,绘制标准曲线,最后含量单位表示 μg/g

菌根参考书
期刊:Mycorrhiza 1.J.R.Norris,D.J.Read,A.K.VARMA.1992.Techniques for mycorrhizal research

2.国内有《菌根学》 《丛枝菌根及其应用》 《丛枝菌根生理生态学》 《AM 培养新技术及其对土地复垦生态效应》 《园艺植物丛枝菌根研究与应用》

刘润进、陈应龙主编 刘润进、李晓林主编 宋福强主编 毕银丽主编 吴强盛主编



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